[发明专利]一种双荧光GLUTs示踪质粒、其制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种双荧光GLUTs示踪质粒、其制备方法及其应用，双荧光GLUTs示踪质粒，包括GLUTs基因片段、mCherry基因和pEGFP‑C1质粒片段；制备方法包括：将GLUTs基因片段插入线性pEGFP‑C1质粒片段的步骤；以及，将mCherry基因插入线性pEGFP‑C1质粒片段的步骤；其应用将双荧光GLUTs示踪质粒转染细胞，然后以激发光激发，观察其显色情况，得到GLUTs在细胞中的定位；双荧光GLUTs示踪质粒，是一种荧光稳定融合、细胞毒性小、定位准确、特异性高、应用简单、价格低廉并能无限扩增的质粒，可示踪GLUTs在细胞亚结构的动态定位。

技术领域

本发明涉及一种双荧光GLUTs示踪质粒、其制备方法及其应用，属于生物检测技术领域。

背景技术

GLUT蛋白家族(GLUTs)由SLC2基因编码，属于主要协助转运蛋白超家族(MFS)成员。在结构上，GLUTs具有12个跨膜区段，一个单一的N端连接糖基化位点，以及一个相对较大的中央细胞质接头结构域。目前已知GLUTs包含14种GLUT蛋白，基于序列同源性和结构相似性分成三个主要类别：I类包括GLUTs(1-4和14)，对葡萄糖具有相对高的特异性；II类包括GLUTs(5,7,9和11)，对果糖具有相对高的特异性；III类包括GLUTs(6,8,10,12和13)，为GLUTs结构非典型成员。GLUTs在人各种类型细胞普遍表达，其分布具有组织特异性和对葡萄糖亲和力的可变性。在功能上，GLUTs通过不依赖能量方式介导细胞内外以及细胞亚结构之间的葡萄糖跨膜双向转运，维持正常细胞代谢。由于葡萄糖转运在细胞代谢和信号传导的关键作用，GLUTs的功能异常与各种疾病密切相关，例如GLUT1缺乏综合征(GLUT1-DS)，Fanconi-Bickel综合征，2型糖尿病和阿尔茨海默病等。值得注意的是，由于Warburg效应，GLUTs在不同类型的实体肿瘤中高表达，进而促进葡萄糖摄取急剧增加，以补偿肿瘤糖酵解产生的低效能ATP；针对潜在癌症诊断或抗癌治疗开发的GLUTs过表达已引起越来越多的关注。基于GLUTs在糖代谢研究中的重要地位，其在不同条件刺激下细胞定位及表达是目前代谢相关研究的热点。目前对GLUTs在细胞内定位及表达水平的研究多采用免疫荧光、质膜分离等技术检测，由于GLUTs的是一种多次跨膜转运蛋白，以上检测技术存在定位模糊、非特异性着色、分离难度大、实验周期长和费用昂贵等缺点；此外，单一荧光蛋白标记质粒只能观察G LUTs在细胞的大体分布而不能直观反映其在细胞的定位改变，因而限制了GL UTs在细胞糖代谢及相关信号传导的深入研究；而现有的双荧光蛋白标记技术仅实现靶基因表达的精准定量检测，无法实现mCherry、EGFP与目的蛋白三者的融合表达，无法示踪GLUTs在细胞亚结构的动态定位。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种双荧光GLU Ts示踪质粒，是一种荧光稳定融合、细胞毒性小、定位准确、特异性高、应用简单、价格低廉并能无限扩增的质粒，可示踪GLUTs在细胞亚结构的动态定位。

本发明的第二个目的在于提供一种上述双荧光GLUTs示踪质粒的制备方法，该制备方法简单，稳定性高，可系统化生产。

本发明的第三个目的在于提供一种上述双荧光GLUTs示踪质粒的应用，在转染含GLUTs基因片段的双荧光GLUTs示踪质粒，观察其显色情况，可以得知GLUTs在细胞中的定位。

实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种双荧光GL UTs示踪质粒，包括GLUTs基因片段、mCherry基因和pEGFP-C1质粒片段；mCherry基因的序列如SEQID NO.1所示；pEGFP-C1质粒片段如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，GLUTs基因片段为GLUT1基因片段或GLUT3基因片段；GLU T1基因片段的序列如SEQ ID NO.3所示；GLUT3基因片段的序列如SEQ ID NO.4所示。

实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种如上所述的双荧光GLUTs示踪质粒的制备方法，包括：