[发明专利]一种胞外酶反应生成乙酰丙酮的方法

权利要求书

1.一种胞外酶反应生成乙酰丙酮的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将乙酰丙酮裂解酶突变体基因Dke1^K15Q连接到表达载体，获得重组载体；所述乙酰丙酮裂解酶突变体基因Dke1^K15Q的序列如SEQ ID NO.2所示；

2)将步骤1)所得重组载体转化宿主菌中，获得重组菌，重组菌发酵培养，获得培养液；

3)将步骤2)所得培养液经过处理，获得乙酰丙酮裂解酶突变体Dke1^K15Q蛋白酶液；

4)将步骤3)所得酶液与反应底物混合后反应，制备得到乙酰丙酮；所述反应底物包括MgCl₂·6H₂O 10mM，KCl 10mM，二硫苏糖醇1mM，Tris-HCl buffer 20mM，FeSO₄·7H₂O0.5mM，甲基乙二醛10mM，乙酸铵10mM。

2.根据权利要求1所述的胞外酶反应生成乙酰丙酮的方法，其特征在于：所述乙酰丙酮裂解酶突变体基因Dke1^K15Q表达的乙酰丙酮裂解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的胞外酶反应生成乙酰丙酮的方法，其特征在于：步骤1)所述表达载体为pETDuet-1。

4.根据权利要求1所述的胞外酶反应生成乙酰丙酮的方法，其特征在于：步骤2)所述宿主菌为大肠杆菌。

5.根据权利要求1所述的胞外酶反应生成乙酰丙酮的方法，其特征在于：步骤2)所述发酵培养是将重组菌接种到发酵培养基中，在37℃、180rpm条件下培养至菌体浓度为OD₆₀₀为0.6～0.8，加入终浓度0.05mM的IPTG后，在30℃条件下培养4-6h，获得培养液。

6.根据权利要求1所述的胞外酶反应生成乙酰丙酮的方法，其特征在于：步骤3)所述处理为：将步骤2)所得培养液经过预处理后，利用超声波破碎培养液中的菌体得到破碎菌液，离心分离破碎菌液后保留上清液，再利用镍柱纯化上清液，获得乙酰丙酮裂解酶突变体Dke1^K15Q蛋白酶液。

7.根据权利要求6所述的胞外酶反应生成乙酰丙酮的方法，其特征在于：所述预处理，是将培养液在4℃、10000rpm下离心5min后，弃去上清，用50mM pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤两次后，再用5mL上述磷酸盐缓冲液重悬；所述超声波破碎，是利用超声波破碎仪在20KHz、60W下处理20min；所述离心分离，是在4℃、13000rpm条件下离心15min。

8.根据权利要求1所述的胞外酶反应生成乙酰丙酮的方法，其特征在于：步骤4)所述反应，反应体系中乙酰丙酮裂解酶突变体Dke1^K15Q蛋白浓度为0.01～1mM。

9.根据权利要求1所述的胞外酶反应生成乙酰丙酮的方法，其特征在于：步骤4)所述反应，在密封条件下进行，反应温度为37℃，反应时间为1～12h，反应环境为180rpm摇床。