[发明专利]一种胞外酶反应生成乙酰丙酮的方法

说明书

本发明公开了一种胞外酶反应生成乙酰丙酮的方法，属于生物工程技术领域。该方法包括以下步骤：1)将乙酰丙酮裂解酶突变体基因Dke1^K15Q连接到表达载体，获得重组载体；2)将步骤1)所得重组载体转化宿主菌中，获得重组菌，重组菌发酵培养，获得培养液；3)将步骤2)所得培养液经过处理，获得酶液；4)将步骤3)所得酶液与反应底物混合后反应，制备得到乙酰丙酮。本发明提供的方法，能够在体外利用酶反应将甲基乙二醛和乙酸铵转化为乙酰丙酮，产量达到388.9mg/L，对于解决全细胞合成体系中乙酰丙酮对于细胞的毒性抑制问题提供了新的思路。

技术领域

本发明涉及一种胞外酶反应生成乙酰丙酮的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

乙酰丙酮，别名2,4-戊二酮，在医药、农业、化工等多个行业具有广泛应用。现有乙酰丙酮主要由化学合成法获得，化学合成法普遍存在得率低、能耗高、成本高、环保压力大等缺点，不符合当今低碳经济的需求。生物法合成效率高、能耗低、成本低、能够避免大量污染物的生成，和化学法相比优势明显。

乙酰丙酮的生物合成方法尚未引起广泛关注。中国专利CN201810865467.0中，通过对来自Acinetobacter johnsonii的乙酰丙酮裂解酶基因核苷酸序列进行优化，在大肠杆菌体内过表达后，首次实现了以葡萄糖为底物发酵生产乙酰丙酮。由于乙酰丙酮对于微生物细胞具有毒性(Water Research,1980,14(3):231-241.)，致使乙酰丙酮的产量还比较低。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种胞外酶反应生成乙酰丙酮的方法，包括以下步骤：

1)将乙酰丙酮裂解酶突变体基因Dke1 K15Q连接到表达载体，获得重组载体；

2)将步骤1)所得重组载体转化宿主菌中，获得重组菌，重组菌发酵培养，获得培养液；

3)将步骤2)所得培养液经过处理，获得酶液；

4)将步骤3)所得酶液与反应底物混合后反应，制备得到乙酰丙酮。

步骤1)所述乙酰丙酮裂解酶突变体基因Dke1 K15Q的序列如SEQ ID NO.2所示。该基因表达的乙酰丙酮裂解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

步骤1)所述表达载体为pETDuet-1。

步骤2)所述宿主菌为大肠杆菌。

步骤2)所述发酵培养是将重组菌接种到发酵培养基中，在37℃、180rpm条件下培养至菌体浓度为OD₆₀₀为0.6～0.8，加入终浓度0.05mM的IPTG后，在30℃条件下培养4-6h，获得培养液。

步骤3)所述处理为：将步骤2)所得培养液经过预处理后，利用超声波破碎培养液中的菌体得到破碎菌液，离心分离破碎菌液后保留上清液，再利用镍柱纯化上清液，获得酶液。

所述预处理，是将培养液在4℃、10000rpm下离心5min后，弃去上清，用50mM pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤两次后，再用5mL上述磷酸盐缓冲液重悬；所述超声波破碎，是利用超声波破碎仪在20KHz、60W下处理20min；所述离心分离，是在4℃、13000rpm条件下离心15min；所述镍柱纯化，是将细胞破碎离心后的上清液倒入经pH7.5的Bindingbuffer处理后的镍柱，液体完全流出后，加入Elution buffer将蛋白洗出并收集得到含有蛋白的酶液。