[发明专利]一种SIRT1基因敲除的IPEC-J2细胞系的构建方法

权利要求书

1.一种SIRT1基因敲除的IPEC-J2细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）针对仔猪SIRT1基因的第一外显子设计并合成gRNA探针，gRNA的碱基序列如SEQ IDNO.1所示，其反向互补序列如SEQ ID NO.2所示；

（2）将如SEQ ID NO.1和2所示的DNA链退火后形成反向互补的双链gRNA探针克隆到pSpCas9-2A-Puro (PX459) V2.0载体中，构建同时表达如SEQ ID NO.1所示sgRNA和Cas9蛋白的质粒；

（3）将步骤（2）构建好的质粒转染到仔猪IPEC-J2细胞；

（4）从步骤（3）转染后的IPEC-J2细胞筛选单克隆突变细胞系，得到SIRT1基因敲除的IPEC-J2细胞系，与野生型细胞系相比，缺少了SIRT1基因第一外显子中的5个碱基，使SIRT1蛋白在翻译过程中发生移码突变，提前终止翻译；

所述步骤（3）中利用Lipo3000进行转染；

所述步骤（4）中，筛选单克隆突变细胞系的方法包括嘌呤毒素结合有限稀释法；

筛选单克隆突变细胞系的方法还包括高分辨率熔解曲线分析。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述嘌呤毒素的浓度为2μg/mL。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述嘌呤毒素的使用方法为：用含有嘌呤毒素的细胞培养基培养细胞，且每天更换新的含有嘌呤毒素的细胞培养基，一共培养7天。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述高分辨率熔解曲线分析包括：

1）高分辨率熔解曲线分析的扩增条件为：98℃ 2 min；98℃ 15 sec，60℃ 20 sec，进行40个循环；95℃ 10 sec；

2）扩增结束后进行熔解曲线分析，从55℃至95℃，每10 sec升高0.2℃，收集信号。

5.采用如权利要求1～4任一项的方法构建的SIRT1基因敲除的IPEC-J2细胞系。