[发明专利]一种SIRT1基因敲除的IPEC-J2细胞系的构建方法

说明书

本发明公开了一种SIRT1基因敲除的IPEC‑J2细胞系的构建方法，包括如下步骤：(1)针对SIRT1基因的第一外显子设计并合成gRNA探针，gRNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其反向互补序列如SEQ ID NO.2所示；(2)将退火后形成反向互补的双链gRNA探针克隆到如图2所示的pSpCas9‑2A‑PuroV2.0载体中，构建同时表达如SEQ ID NO.1所示sgRNA和Cas9蛋白的质粒；(3)将步骤(2)构建好的质粒转染到IPEC‑J2细胞；(4)从步骤(3)转染后的IPEC‑J2细胞筛选单克隆突变细胞系，得到SIRT1基因敲除的IPEC‑J2细胞系，其相比野生型细胞系，缺少了SIRT1基因第一外显子中的5个碱基。本发明首次构建SIRT1基因敲除的IPEC‑J2细胞系，筛选得到稳定的单克隆SIRT1基因敲除IPEC‑J2纯合细胞系，可作为研究仔猪肠道氧化应激的细胞模型。

技术领域

本发明涉及基因敲除技术领域，尤其是一种SIRT1基因敲除的IPEC-J2细胞系的构建方法。

背景技术

IPEC-J2细胞是从新生仔猪中空肠中分离的猪肠柱状上皮细胞。当在0.4μm孔径滤器上培养时，该细胞系形成具有高跨上皮电阻的极化单层。与常见的人结肠衍生系HT-29，T84和Caco-2相比，IPEC-J2细胞的独特之处在于它来自猪小肠组织并且未被转化(与IPI-2I相比)。猪肠上皮细胞比啮齿类动物的肠上皮细胞系(例如IEC-6或IEC-18)更加接近的模拟人类肠上皮生理学，这在人畜共患病感染的研究中尤为重要。此外，IPEC-J2细胞越来越多地用于肠道氧化应激研究，它们为研究断奶仔猪肠道健康提供了特异性模型，以检测各种外源抗氧化剂与肠上皮细胞之间的相互作用，被用作潜在饲用抗氧化剂的初始筛选工具。

SIRT1(Silent mating type information regulation 2 homologue 1)是哺乳动物中高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)依赖性蛋白脱乙酰基酶，在代谢调节、发育、肿瘤发生以及衰老等生理病理过程中至关重要。作为哺乳动物组织中主要的核Sirtuin，SIRT1是一种关键的代谢传感器，通过调节细胞应激反应、能量代谢、细胞凋亡、炎症等生物过程，以响应外界环境信号。在过去几年中，SIRT1已被鉴定为多种组织/细胞中氧化应激和炎症的关键阻遏物。最近的一些研究表明SIRT1在调节肠道炎症和组织氧化-还原稳态中起着关键作用。然而，SIRT1是否刺激或抑制肠道应激仍存在争议，肠上皮SIRT1如何调节复杂的环境-宿主相互作用以调节肠上皮完整性尚不清楚。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种构建SIRT1基因敲除的IPEC-J2细胞系的构建方法，采用该方法能筛选得到稳定的单克隆SIRT1基因敲除IPEC-J2纯合细胞系，可作为研究仔猪肠道氧化应激的细胞模型。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种SIRT1基因敲除的IPEC-J2细胞系的构建方法，包括如下步骤：

(1)针对SIRT1基因的第一外显子设计并合成gRNA探针，gRNA的碱基序列如SEQ IDNO.1所示，其反向互补序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)将如SEQ ID NO.1和2所示的DNA链退火后形成反向互补的双链gRNA探针克隆到如图2所示的pSpCas9-2A-Puro(PX459)V2.0载体中，构建同时表达如SEQ ID NO.1所示sgRNA和Cas9蛋白的质粒；

(3)将步骤(2)构建好的质粒转染到IPEC-J2细胞；