[发明专利]刺参Bax基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参Bax基因工程菌构建方法和应用

权利要求书

1.一种刺参Bax基因，其特征在于该基因为SEQID NO.1所示的cDNA序列。

2.一种权利要求1所述的刺参Bax基因的克隆方法，其特征在于步骤如下：根据与Bax基因同源的表达序列标签EST序列设计RACE的巢式引物，采用RACE技术扩增基因全长，具体步骤如下：

（1）通过对腐皮综合症发病刺参和健康刺参体腔细胞高通量转录组测序和表达谱分析，发现了多条编码Bax基因的EST序列，选取编码刺参BPI部分片段的EST克隆；

（2）RACE引物设计：根据编码刺参BPI部分片段的EST克隆设计RACE的巢式引物：3’上游特异性引物1：CGTTTTCGCATCAAGACTCGCG，3’上游特异性引物2：GGAGGAATGGCAACTTTGAGGCT；扩增3’接头引物outer3：AGCCTCAAAGTTGCCATTCCTCC，扩增3’接头引物inner3：GAATAGCCTCTCAAAGTTGCCATTCCTCCAAGAAA；

（3）RACE扩增获取刺参Bax基因全长序列，具体步骤如下：

a．总RNA提取：通过刺参体腔液收集体腔细胞制备RNA提取液；

b．3’-RACE扩增：将RNA提取液用3’-Full RACE Core Set with PrimeScript™ RTase试剂盒逆转录合成扩增3’的模板，以此为模板使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物outer3进行PCR 扩增，取PCR产物1μL作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物inner3进行PCR扩增得到3’端目的条带；

c．将扩增产物3’端目的条带用凝胶回收试剂盒回收，回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50 ug/mL的LB平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得到刺参Bax基因全长序列，其基因序列如SEQIDNO.1所示。

3.根据权利要求2所述的一种刺参Bax基因的克隆方法，其特征在于上述RACE扩增反应体系及反应条件：模板1.0 μL，含Mg²⁺的10×PCR缓冲液 2.5 μL，浓度2.5 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM的特异性引物1.0 μL，浓度10 μM的接头引物 1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水：17.3 μL；扩增条件：95 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 120 s、72 ℃ 1min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

4.一种权利要求1所述的刺参Bax基因的编码蛋白，其特征在于该编码蛋白为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。

5.一种权利要求4所述的刺参Bax开放阅读框基因序列蛋白质，其特征在于该蛋白质为SEQID NO.3所示的氨基酸序列。

6.一种利用权利要求5所述的刺参Bax开放阅读框基因序列蛋白质基因构建重组刺参Bax基因工程菌的方法，其特征在于步骤如下：

（1）设计PCR引物，用分别含有BamHI位点和Not I位点的引物扩增刺参Bax开放阅读框基因序列，即权利要求6所述的刺参Bax开放阅读框基因序列蛋白质；

（2）将克隆得到的目的基因插入pET28a（+）载体，获得重组质粒pET28a（+）-Bax；

（3）对重组质粒pET28a（+）-Bax进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基因工程菌。