[发明专利]刺参Bax基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参Bax基因工程菌构建方法和应用

说明书

本发明公开了刺参Bax基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参Bax基因工程菌构建方法和多克隆抗体制备方法，特点是刺参Bax基因序列如SEQIDNO.1所示；刺参Bax编码蛋白序列如SEQIDNO.2所示，其开放阅读框蛋白氨基酸序列如SEQID NO.3所示；用分别含有BamHI位点和Not I位点的引物扩增刺参Bax蛋白的开放阅读框基因序列；将克隆得到的目的基因插入载体获得重组质粒，对重组质粒进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基因工程菌，优点是获得的重组复性蛋白具有诱导刺参体腔细胞凋亡的作用，且根据其蛋白序列制备的多克隆抗体具有减缓刺参体腔细胞凋亡以及修复刺参腐皮综合症创面的作用。

技术领域

本发明属于分子生物学以及基因工程领域，尤其是涉及一种刺参Bax基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参Bax基因工程菌构建方法和多克隆抗体制备方法。

背景技术

细胞凋亡是一种为维持内环境稳定，由内部遗传机制控制，按照自身程序进行的活动和生理性死亡过程。当受到外源性和内源性因素（辐射、有机毒物和重金属、病原感染）刺激时，宿主中受损、多余和危险的细胞主要通过外源性和内源性途径清除。因此，细胞凋亡被认为是一种主动的先天性免疫防御机制，尤其是对于无适应性免疫的无脊椎动物。根据作用方式的不同，细胞凋亡可以分为促细胞凋亡和抑细胞凋亡两大类。机体中正常的细胞处在连续增殖与细胞凋亡的平衡中，而细胞凋亡发生与否受到机体细胞中促凋亡蛋白与抑凋亡蛋白的相对比例所调控。若促凋亡蛋白过表达则会表现出机体健康细胞的自杀，如艾滋病、局部缺血、精神变性紊乱等；若抑凋亡蛋白过表达则会导致细胞的无限繁殖，如癌症等。因此，细胞凋亡相关蛋白在机体内的平衡表达对于宿主的健康发展至关重要。

Bax（Bcl-2-associated X protein）蛋白是鉴定的第一个促细胞凋亡蛋白，它主要通过改变线粒体膜电位并释放细胞色素c（Cyt c），释放的Cyt c进而与凋亡蛋白酶活化因子形成多聚复合体并启动caspase级联反应中的caspase-3和caspase-7，完成相应底物的剪切，从而引起细胞凋亡。近年来研究表明Bax的表达与人类疾病的发生和发展过程密切相关。研究发现，Bax的表达水平与肿瘤的分化程度、临床分期等指标密切相关；而且，Bax的特异性抗体还用来治疗因Bax过度表达而导致的乳腺癌发生等疾病。然而，目前对于Bax生物学功能的研究主要集中在人和其他哺乳动物，在低等脊椎动物和无脊椎动物中的研究相对较少。而此类细胞凋亡调节蛋白的出现，不但为临床抗感染治疗提供了新的“武器”，而且为解决针对性的靶向治疗疾病提供了新的思路。因此，深入研究主要水产养殖品种免疫防御机制，为解决海水养殖业病害预防，开展健康养殖和实现养殖业可持续发展具有重要意义。

刺参（Apostichopus japanicus），是属于棘皮动物门（Echinodermata）、海参纲（Holothuridea）、循手目（Aspidochirota）的重要经济种类，是一种高蛋白、低脂肪、低糖、无胆固醇的重要经济养殖水产动物。但由灿烂弧菌为主要病原引起的刺参腐皮综合症严重制约了该产业的健康和可持续发展。目前在防治刺参腐皮综合症中，大多使用抗生素和水体消毒剂防治，但抗生素的大量使用诱导致病菌产生耐药性，导致抗生素失效，水体消毒剂往往对刺参有较大的刺激作用。作为海洋无脊椎动物，刺参的免疫应答主要由体腔细胞和体腔液中的免疫因子共同介导的。前期研究同样表明，刺参体腔细胞的功能类似于脊椎动物血细胞功能，在病原入侵下能够发挥细胞免疫和体液免疫的作用。因此，从刺参本身入手，深度解析其免疫防御机制，构建水产动物自身细胞凋亡调控基因表达工程菌及相应抗体，进而产业化高产量且价格低廉的防治腐皮综合症的天然制剂已迫在眉睫。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种刺参Bax基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参Bax基因工程菌构建方法和多克隆抗体制备方法，该重组表达的Bax蛋白能够诱导刺参体腔细胞凋亡，Bax多克隆抗体处理灿烂弧菌感染后的刺参，患腐皮综合症刺参创面能够得到明显修复。