[发明专利]重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法

权利要求书

1.重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)蛋白工作种子批菌种开启后接种于一个三角瓶中，接种量为菌种：培养基＝1ml：100ml，培养6～10小时，为一代生产菌种；

(2)将一代生产菌种接种于种子罐中进行传二代培养，接种量为一代菌种：培养基＝1ml：2000ml，培养6～10小时，为二代生产菌种；培养过程中每小时取样检测OD600值，当OD600值大于1.5时种子罐培养结束，结束后取菌液样品进行染色镜检，细菌应为革兰氏阴性杆菌；

(3)将二代生产菌种接种于发酵罐中进行传三代培养，接种量为二代菌种：培养基＝1ml：9ml培养结束后取菌液样品进行染色镜检，细菌应为革兰氏阴性杆菌；

(4)发酵结束后，菌液通过连续流离心去除上清收获菌体；

(5)领取菌体使其溶解，待菌体溶解后，使用匀质机破菌，收集上清，澄清过滤；

(6)按照5ml：1ml将破菌上清与谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和填料混合；在20～25℃条件下进行结合，结合时间4～10h，结合完成后，对其进行清洗，清洗完成后按照凝胶：PP酶溶液＝5ml：1ml加入PP酶溶液，垂直混悬器转速为11～12rpm，20～25℃条件下进行酶切6～12h，酶切完成后，收获酶切液，除菌过滤；

(7)采用层析柱对蛋白酶切液进行纯化；

(8)采用层析柱对蛋白液进行脱盐；

(9)采用层析柱对蛋白脱盐样去内毒素；

(10)将去内毒素的蛋白溶液经除菌过滤，放-80℃冰柜保存。

2.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法，其特征在于，步骤(1)中，每个三角瓶装25±2mlLB液体培养基，放置于恒温振荡培养器36～38℃，180～300rpm培养6～10小时，为一代生产菌种。

3.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法，其特征在于，步骤(2)中种子罐装有LB液体培养基30L，控制种子罐参数为温度：36～38℃、50～500rpm、空气流量：30～70L/min、pH:7.2～7.5培养6～10小时。

4.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法，其特征在于，步骤(3)中，发酵罐装有TB液体培养基270L，控制发酵罐参数为温度：36～38℃、100～600rpm、空气流量：100～400L/min、pH:7.2～7.5，溶氧：40％～50％；控制溶氧时，当控制参数达到规定范围最大值，溶氧继续下降时，保持其它不变，增加通入纯氧进行控制溶氧，培养6～10小时，培养过程中增加补料；当出现pH和溶氧出现上升的情况，开始降低培养温度至29～31℃，通过调节转速和通气控制溶氧：40％～50％，pH:7.2～7.5，参数稳定后加入异丙基硫代半乳糖苷使其终浓度为1mM，开始诱导，诱导5h培养结束。

5.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法，其特征在于，步骤(5)中，使用匀质机破菌时，其控制参数为：调节压力为750±50bar，冷凝系统温度为2～8℃，破碎3次；将破碎好的菌液进行离心，离心力为12000g，20min，4℃，收集上清，澄清过滤。

6.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法，其特征在于，步骤(6)中，结合完成后，共用4个胶体积的20mM PB+0.5M pH为7.5的NaCl溶液清洗，接着用5个胶体积的室温注射水清洗，再用1个胶体积酶切缓冲液进行清洗，其中酶切缓冲液为20mMPB和0.15M NaCl混合的pH为7.5的溶液。

7.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法，其特征在于，步骤(1)中蛋白工作种子批菌种为MntC或HI或mSEB或SpA5中的一种。

8.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法，其特征在于，步骤(8)中，采用采用G25层析柱对蛋白液进行脱盐。