[发明专利]一种链霉素适配体的Non-SELEX筛选方法

权利要求书

1.一种链霉素适配体的Non-SELEX筛选方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）将5 μL浓度20 g/L的小分子靶标链霉素与45 μL浓度100 μmol/L的变性处理后随机ssDNA文库室温混合孵育30 min，形成由靶标-ssDNA复合物、游离ssDNA和游离靶标组成的混合物溶液；所述随机ssDNA文库是指由两端各22个核苷酸构成的固定引物序列和中间40个核苷酸构成的随机序列组成的寡核苷酸库：5'-TAG GGA ATT CGT CGA CGG ATC C-N40-CTG CAG GTC GAC GCA TGC GCC G-3'；所述变性处理是指先将文库95 ℃加热10 min，再立即冰浴10 min；

（2）将混合物溶液注入毛细管柱进行毛细管电泳分离，从电泳开始到游离ssDNA电泳峰前沿之间的时间段被用作收集时间窗口，收集其间从毛细管中流出的溶液；此过程重复10次，合并该10次过程中收集到的电泳流出溶液作为次级文库，至此第1轮筛选结束；所述毛细管电泳分离按如下电泳条件进行：熔融石英毛细管，长度60 cm，有效长度50 cm，内径100μm；运行缓冲液为80 mmol/L的硼酸盐缓冲液，pH 9.24；分离电压+20 kV；温度25 ℃；进样压力0.1379 MPa，进样时间10 s；检测波长190 nm；所述收集时间窗口是指电泳开始后的0-17 min；

（3）取45 μL变性处理后的次级文库与5 μL浓度20 g/L的链霉素室温混合孵育30 min，重复步骤（2），完成第2轮筛选；第3轮以后筛选步骤同第2轮；

（4）对第4轮筛选后获得的收集溶液进行对称PCR，对PCR扩增产物进行凝胶电泳纯化，纯化后产物进行高通量测序；所述对称PCR按如下扩增条件进行：浓度5 μmol/L的上游引物5'-TAG GGA ATT CGT CGA CGG AT加入量2 μL，浓度5 μmol/L的下游引物CGG CGC ATG CGTCGA CCT G-3'加入量2 μL，第4轮收集溶液加入量2 μL，Mix 25 μL，用去离子水定容至50 μL；预变性温度95 ℃，持续时间5 min；变性温度95 ℃，持续时间30 s；退火温度60℃，持续时间30 s；延伸温度72 ℃，持续时间30 s；循环35次；继续延伸温度72 ℃，持续时间5 min；所述凝胶电泳纯化按如下条件进行：琼脂糖凝胶中PCR扩增产物引入量100-200 μL，分离电压80 V，分离时间60 min；切84 bp处条带，用胶回收试剂盒进行回收；

（5）从测序结果中将出现频率由高至低排列在前7位的序列选出并进行合成；

（6）对合成的各序列测定解离常数，从中选出解离常数最小的序列，此即最后确定的链霉素适配体；所述测定解离常数按如下步骤进行：对合成的序列进行变性处理，将400 μL链霉素-磁珠复合物分别与浓度为50、100、200、400、800、1000 nmol/L的各变性处理后序列室温孵育60 min；磁分离后用结合缓冲液将磁珠冲洗3次；然后向磁珠中加入50 μL洗脱缓冲液，80 ℃洗脱10 min，重复洗脱2次；合并2次洗脱后的上清液，测定其中ssDNA的浓度；对测定值按方程y=B_max×x/(K_d+x)进行非线性拟合，其中y为测得值，x为孵育前各溶液配制浓度，K_d为解离常数。