[发明专利]一种链霉素适配体的Non-SELEX筛选方法

说明书

本发明为一种链霉素适配体的Non‑SELEX筛选方法。对链霉素与随机单链寡核苷酸文库混合孵育后的溶液进行毛细管电泳分离，利用单链寡核苷酸与链霉素结合后与游离单链寡核苷酸的质荷比差异可使二者分离。将电泳开始后的0‑17min作为收集时间窗口，可以有效收集与链霉素结合的单链寡核苷酸。将其作为次级文库再次筛选，经过仅4轮筛选即可得到对链霉素具有高亲和力适配体。

技术领域

本发明涉及生物分离技术领域，具体涉及一种用于小分子靶标链霉素适配体筛选的Non-SELEX方法。

背景技术

适配体是筛选自人工合成随机寡核苷酸文库的单链脱氧核糖核酸(ssDNA)序列或核糖核酸序列，这些序列通过碱基互补配对作用可形成二级甚至三级结构。这些高级结构使得它们能够识别并结合到特定的靶物质上，并且能够识别靶物质仅仅一个羟基或甲基的结构差异，甚至能够区分手性对映体。适配体对靶物质的优异识别性能使其在生物、医学、分析检测(包括食品安全检测)等领域展现了广阔的应用前景。

随机寡核苷酸文库中约含有10¹⁵个长度为20-220nt的序列，从数量如此庞大的文库中将某个或某几个对特定靶物质具有高特异性和高亲和性的序列筛选出来并非易事。目前，适配体的筛选方法主要是以指数富集配体系统进化(SELEX)方法为基础的各种方法，包括磁珠法、琼脂糖珠法、Cell-SELEX、微孔板法、CE-SELEX等。CE-SELEX将毛细管电泳高效分离的特点与SELEX相结合，利用ssDNA与靶标结合后形成的复合物与游离ssDNA的质荷比差异使后者与前者分离，收集复合物进行PCR扩增、纯化后用于下一轮筛选，直至获得适配体。Non-SELEX在CE-SELEX的基础上，将上一轮收集得到的ssDNA作为次级文库直接进入下一轮筛选，直至最后一轮才对收集得到的ssDNA进行PCR扩增和纯化，然后进行测序，省却中间轮次间的PCR扩增和纯化过程，此方法大大简化了筛选过程。然而，此方法和CE-SELEX目前都是应用于大分子靶物质，例如蛋白质的适配体的筛选，主要原因是大分子靶与ssDNA结合后的复合物与游离ssDNA的质荷比差异较大，易于分离。对于小分子靶物质来说，与ssDNA结合后的复合物与游离ssDNA的质荷比差异很小，其复合物的获得十分困难，尚无用于小分子靶物质适配体筛选的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于小分子物质链霉素适配体筛选的Non-SELEX方法，为高效筛选小分子物质的适配体提供一条可行途径。

具体步骤如下：

1、一种链霉素适配体的Non-SELEX筛选方法，其特征在于：所述的适配体筛选按如下步骤进行：

(1)将5μL浓度20g/L的小分子靶标链霉素与45μL浓度100μmol/L的变性处理后随机ssDNA文库室温混合孵育30min，形成由靶标-ssDNA复合物、游离ssDNA和游离靶标组成的混合物溶液。

(2)将混合物溶液注入毛细管柱进行毛细管电泳分离，从电泳开始到游离ssDNA电泳峰前沿之间的时间段被用作收集时间窗口，收集其间从毛细管中流出的溶液。此过程重复10次，合并该10次过程中收集到的电泳流出溶液作为次级文库，至此第1轮筛选结束。

(3)取45μL变性处理后的次级文库与5μL浓度20g/L的链霉素室温混合孵育30min，重复步骤(2)，完成第2轮筛选。第3轮以后筛选步骤同第2轮。

(4)对第4轮筛选后获得的收集溶液进行对称PCR，对PCR扩增产物进行凝胶电泳纯化，纯化后产物进行高通量测序。

(5)从测序结果中将出现频率由高至低排列在前7位的序列选出并进行合成。

(6)对合成的各序列测定解离常数，从中选出解离常数最小的序列，此即最后确定的链霉素适配体。