[发明专利]Herbicidin生物合成基因簇及其应用

说明书

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种用于提高发酵herbicidin F及其类似物产量的方法，所述方法为：在发酵生产herbicidin F及其类似物的宿主菌株中过表达HcdR2基因。所述的宿主菌株为链霉菌，优选为S.mobaraensis US‑43菌株。所述的HcdR2为LuxR蛋白家族的转录调节蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明还涉及一组新的herbicidin F的结构类似化合物。

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体而言，涉及一种Herbicidin生物合成基因簇及其应用。

背景技术

Streptomyces mobaraensis US-43(之前命名为S.verticillusvar.pingyangensis n.var)是从中国浙江平阳土壤当中分离得到的一株链霉菌，它可以产生一系列与bleomycin性质相同的糖肽类抗生素^[1-3]，其中，pingyangmycin与boanmycin已经被SFDA批准作为抗肿瘤药物。作为实验室保藏菌株，我们研究该菌株在不同发酵条件下的次级代谢产物，在其发酵液中已经发现了piericidin A1以及一系列isocoumarins化合物。此外，通过LC-MS方法检测到发酵液中的一种微量组分，该组分经UV、MS/MS数据鉴定，推测为herbicidin F。

Herbicidins(图1)是由腺苷衍生而来的核苷类抗生素，此类化合物具有独特的furano-pyrano-pyran三环核心结构，该三环结构经后期加工修饰，可加入不同的侧链基团，因而结构丰富。根据报道，在S.saganonensis^[4-7]，S.sp.L-9-10^[8]，S.scopuliridisRB72^[9]和S.sp.CB01388^[10]这些菌株中能够分离得到herbicidins化合物。Herbicidins化合物具有多种生物活性，herbicidins化合物除对双子叶植物具有选择除草活性外^[4]，还具有显著的抗藻类和抗真菌活性^[6]，最近一篇文献报道了herbicidin骨架结构也具有anti-Cryptosporidium活性^[10]。Herbicidins复杂的化学结构以及多种生物活性引起我们对其结构类似物及生物合成机制的探究。

Herbicidin F的结构已经确定^[6]，但在本工作开始之前，其生物合成基因簇还未见报道。Aureonuclemycin(Figure 1)是herbicidin F的结构类似物，它们具有相同的三环核心结构，但herbicidin F比aureonuclemycin化学结构中多一个tiglyl基团和两个甲基基团。唐功利课题组^[11]一篇专利报道了aureonuclemycin的生物合成基因簇，aureonuclemycin由4个关键基因(anmB，anmC，anmD和anmE)催化合成，在最近一篇关于herbicidins生物合成途径的文章中4个关键基因的功能得到验证^[12]，这4个关键基因为寻找鉴定herbicidins生物合成基因簇提供了重要线索。通过生物信息学分析，我们在S.mobaraensis US-43基因组中发现了与上述4个关键基因同源的基因序列，进而成功定位和鉴定了herbicidin F的生物合成基因簇hcd，该基因簇与已经报道的负责herbicidins生物合成的her(S.sp.L-9-10^[13])与hbc(S.sp.KIB-027^[12])两个基因簇高度同源。此外，通过过表达分析证明，途径特异性调控因子hcdR2在herbicidin F的生物合成中发挥了正向调控作用，在hcdR2过表达菌株当中，herbicidin F的产量显著提高，为herbicidin F进行NMR结构鉴定提供了便利。