[发明专利]一种化学裂解法制备T载体的方法在审
| 申请号： | 201910473843.6 | 申请日： | 2019-06-01 |
| 公开（公告）号： | CN110129347A | 公开（公告）日： | 2019-08-16 |
| 发明（设计）人： | 田文奇;袁慧 | 申请（专利权）人： | 苏州博睐恒生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/63 | 分类号： | C12N15/63 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 215300 江苏省苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 化学裂解法 制备 限制性核酸内切酶 野生型质粒 末端脱氧核苷酸转移酶 线性化载体 技术缺陷 嵌合引物 消化处理 质粒载体 线性化 扩增 阴性 克隆 | ||
1.一种化学裂解法制备T载体的方法，其特征在于，包括步骤为：（1）利用RNA-DNA嵌合引物扩增质粒载体，得到扩增后的质粒载体；（2）用限制性核酸内切酶Dpn I消除步骤（1）得到的所述扩增后的质粒载体中的环状质粒模板；（3）根据步骤（1）中所述RNA-DNA嵌合引物的修饰特征，对步骤（2）限制性核酸内切酶DpnI处理后的质粒载体PCR片段进行化学裂解法处理，得到T载体。
2.根据权利要求1所述的化学裂解法制备T载体的方法，其特征在于，步骤（1）中所述RNA-DNA嵌合引物的序列特征为：（a）5’末端第1位的碱基为RNA碱基rA；（b）3’端碱基序列与待扩增质粒载体的DNA片段配对。
3.根据权利要求1所述的化学裂解法制备T载体的方法，其特征在于，步骤（1）中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增质粒载体的正向引物、用于扩增质粒载体的反向引物、质粒模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。
4.根据权利要求1所述的化学裂解法制备T载体的方法，其特征在于，步骤（3）中所述化学裂解法是碱裂解。
5.根据权利要求4所述的化学裂解法制备T载体的方法，其特征在于，所述碱裂解是在质粒载体PCR片段中加入终浓度为10-100 mM的碱性溶液，并在60-90度下加热1-30分钟，去除rA碱基，制备3’端带1个T碱基的T载体。
6.根据权利要求5所述的化学裂解法制备T载体的方法，其特征在于，所述碱性溶液为氢氧化钠溶液。
7.根据权利要求5所述的化学裂解法制备T载体的方法，其特征在于，所述碱裂解还包括在去除rA碱基后，用纯化DNA的试剂盒或冷乙醇沉淀技术去除非DNA组份，制备3’端带1个T碱基的T载体。
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