[发明专利]一种化学裂解法制备T载体的方法

说明书

本发明公开了一种化学裂解法制备T载体的方法，利用RNA‑DNA嵌合引物扩增质粒载体；用限制性核酸内切酶Dpn I对野生型质粒模板进行消化处理，消除野生型质粒导致的阴性背景克隆；将PCR扩增的线性化载体进行化学裂解法处理，得到T载体。通过上述方式，本发明的方法直接简单的PCR扩增即可制备T载体的线性化片段，消除了限制性核酸内切酶法和末端脱氧核苷酸转移酶法的技术缺陷，简单处理便能得到T载体。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种化学裂解法制备T载体的方法。

背景技术

基于限制性核酸内切酶与DNA连接酶的传统基因克隆缺点主要有：1）限制性内切酶的选择较为麻烦，对于长片段基因经常找不到合适好用的限制性酶切位点，导致无法进行该基因的克隆；2）不同基因选择的内切酶不一样，需要不同的限制性内切酶进行处理，因此很难同时克隆多个基因。

为了解决上述技术缺陷，发明了T载体和TA克隆技术。T载体是线性化载体DNA的3’端附加了一个单链状态T碱基的载体。Taq DNA聚合酶等可以在目标基因的PCR产物的3’端加上一个单链状态的A碱基。将带3’A碱基的目标基因与T载体混合，A-T配对后，在DNA连接酶的作用下，将二者连接在一起，形成闭环重组DNA。基于T载体的TA克隆的操作通量大，可以用于高通量基因克隆，同时克隆几百个基因，因此正在替代基于限制性内切酶的传统基因克隆技术。

目前制备T载体的方法主要有限制性酶切法、末端脱氧核苷酸转移酶法，但二者都有一定缺陷。限制性酶切法可用的限制性酶有限，只有少数几种，价格昂贵，而且要在原始载体的多克隆位点区域预先引入这种专门制备T载体的酶切位点（前后两个），导致每构建一种新的T载体就要制备一种这种特定的原始载体，非常耗时，且通用性极差。另外酶切后要把切掉的小片段去除，不然在DNA连接酶反应中会被重新连接形成空载体。更大的缺点是，酶切反应的好坏直接决定着T载体能否制备成功，如果酶切不彻底，剩余的环状载体和只发生单位点酶切的载体，在后续的DNA连接反应中会产生大量的空载体（不含目的基因），导致阳性克隆率过低，筛选不到阳性克隆。末端脱氧核苷酸转移酶法先用平末端限制性内切酶，例如EcoRV，将环状质粒切成平末端的线性质粒，然后利用末端脱氧核苷酸转移酶在双链DNA的3’末端加上一个T碱基，从而制备T载体。该方法虽然能够制备T载体，但由于末端脱氧核苷酸转移酶能够在3’末端加上一个到数个T碱基，因而很难控制在末端加上的T碱基的数量，而只有加一个T碱基的情况才是需要的T载体。另外两种方法中环状的野生型模板质粒的去除都没有好的策略，会带来较高的阴性克隆背景。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种化学裂解法制备T载体的方法，得到的T载体可以用于TA克隆中，也可用于需要进行DNA文库构建的基因克隆、精准医疗、病毒载体构建等领域。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种化学裂解法制备T载体的方法，包括步骤为：（1）利用RNA-DNA嵌合引物扩增质粒载体，得到扩增后的质粒载体；（2）用限制性核酸内切酶Dpn I消除步骤（1）得到的所述扩增后的质粒载体中的环状质粒模板；（3）根据步骤（1）中所述RNA-DNA嵌合引物的修饰特征，对步骤（2）限制性核酸内切酶DpnI处理后的质粒载体PCR片段进行化学裂解法处理，得到T载体。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述RNA-DNA嵌合引物的序列特征为：（a）5’末端第1位的碱基为RNA碱基rA；（b）3’端碱基序列与待扩增质粒载体的DNA片段配对。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增质粒载体的正向引物、用于扩增质粒载体的反向引物、质粒模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（3）中所述化学裂解法是碱裂解。