[发明专利]一种促进山羊毛囊干细胞增殖的方法

说明书

本发明涉及一种促进山羊毛囊干细胞增殖的方法，提供了一段可以特异性的降低山羊毛囊干细胞中CMTM3基因mRNA的表达水平的shRNA，该片段与载体pDC316‑ZsGreen‑shRNA连接组成干扰载体pDC316‑ZsGreen‑shRNA‑CMTM3，将该干扰载体导入到山羊毛囊干细胞中可以降低基因CMTM3 mRNA的表达水平，从而促进毛囊干细胞增殖。在培养基中添加生理浓度的雄激素也能增加细胞活力，促进毛囊干细胞增殖，减少细胞凋亡率。当二者同时作用时在所有处理组中促增殖效果最明显，二者作用相互协同。本发明的shRNA为后续转基因山羊育种材料的获得提供了技术支撑。

技术领域

本发明属于生物学领域，具体涉及一种在山羊毛囊干细胞中特异性的降低CMTM3基因表达水平以促进山羊毛囊干细胞增殖的方法。

背景技术

毛囊是研究体干细胞的理想系统，毛囊干细胞与毛囊周期状态密切相关，毛囊干细胞在受到外界刺激如皮肤损伤或者剪毛等，毛囊干细胞发生募集，促进皮肤修复和毛发生成。

在一些癌症中发现CMTM3基因丢失，被认为是一种可能的肿瘤抑制基因，有研究报道CMTM3在胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、食管癌、结肠癌和肾癌中被抑制或下调，睾丸癌细胞中发现CMTM3通过增加G2期细胞比例，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖。其途径主要是通过甲基化，其表达与启动子CpG甲基化状态呈负相关。

雄性激素主要是指由性腺(睾丸)合成的一类内分泌激素，主要由睾丸间质细胞合成，此外，肾上腺皮质和卵巢也能合成少量的雄性激素，要包括睾酮、雄烯二酮和脱氢表雄酮，睾酮是其最主要的形式，雄激素功能的行使需依靠5α还原酶的作用。激素的生物活性是由其细胞内受体(核受体)所介导，该受体属于配体依赖的转录因子超家族，雄激素和雄激素受体(androgen receptor，AR)结合后通过一系列受体后机制，将AR转移到核内，配体-受体复合物和DNA上的配体结合区域结合，激活激素应答元件，进而调控基因表达和影响蛋白质合成。

雄激素对毛发的正常生长起重要的调节作用，不同时期对不同部位的毛发生长具有特定的刺激或抑制作用。普遍认为，雄激素的作用机制是通过毛细血管到达毛乳头细胞并和毛乳头细胞中AR结合，促发激素应答元件，改变DPC旁分泌产生可溶性的调节性分子作用于毛囊上皮成分而影响毛发生长。

腺病毒(Adenovirus)是一种，直径为70～90nm的无包膜的双链线性DNA病毒，由252个壳粒呈二十面体排列构成基因组长约36kb。腺病毒外源基因装载容量大，且能够感染绝大多数哺乳动物细胞，包括分裂和不分裂的细胞；除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒适用于在难以转染的细胞中进行RNA干扰、过表达特定基因或过表达特定microRNA研究和invivo实验。

常用重组腺病毒系统包括腺病毒骨架载体(携带腺病毒主要功能基因)又称为整合载体、穿梭载体(转移外源基因表达盒到骨架载体上)。目前应用最为广泛的是AdMax腺病毒载体系统，骨架质粒和穿梭载体共转染293细胞后，在细胞内中通过Cre/loxP实现载体重组，进而产生重组腺病毒。通过裂解细胞收获病毒粒子，病毒粒子经过反复扩增与纯化可得到高滴度的腺病毒。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种促进山羊毛囊干细胞增殖的方法，即一种在山羊毛囊干细胞中特异性的降低CMTM3基因表达量以促进山羊毛囊干细胞增殖的方法。

本发明的技术方案如下：

一种促进山羊毛囊干细胞增殖的方法，其特征在于，构建CMTM3基因的干扰表达载体pDC316-ZsGreen-shRNA-CMTM3，将该载体导入山羊毛囊干细胞，通过降低毛囊干细胞中CMTM3基因的表达水平，从而促进山羊毛囊干细胞的增殖。

优选地，所述载体为阳性重组载体，其获得过程如下：