[发明专利]一种单加氧酶DszC突变体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种单加氧酶DszC突变体，该单加氧酶DszC突变体对4S途径终产物HBP反馈抑制脱敏，其特征在于：该单加氧酶DszC突变体是将来源于Rhodococcuserythropolis IGTS8的DszC的第101位丙氨酸突变为赖氨酸，第327位色氨酸突变为半胱氨酸，氨基酸序列如SEQNO:4所示。

2.如权利要求1所述的单加氧酶DszC突变体，其特征在于：编码该DszC突变体的核苷酸序列如SEQNO:3所示。

3.一种制备权利要求1或2所述的单加氧酶DszC突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以SEQ NO:1所示的野生型DszC的核苷酸序列为模板，通过易错PCR引物EP-S/EP-A、使用低保真DNA聚合酶rTaq酶和添加一定量的MnSO4对DszC进行随机突变；

(2)步骤(1)的突变基因和含有4S途径其余三个基因dszA、dszB和dszD的表达载体pSB4A5-BAD经Nhe I和HindⅢ双酶切、T4连接酶连接后转化表达宿主E.coli BL21(DE3)；

(3)将(2)中获得的突变子逐一挑至无菌96孔板中，在含有氨苄青霉素的LB培养基中35～38℃震荡培养过夜，即得母板；将母板中的菌复制至深孔96孔板，获得子板；子板中的菌在如上条件下培养过夜，加入IPTG进行诱导，继续相同条件培养3～6小时后，加入一定量的DBT作为全细胞催化反应的底物，27～35℃震荡反应24小时；

(4)取一定量子板中的发酵液在600nm下测量菌体浓度OD₆₀₀；

(5)把子板剩余发酵液进行离心，取上清至干净的96孔酶标版，用Na₂CO₃调节pH至9～10之间，用Gibss乙醇溶液进行显色反应，在610nm下测量蓝色络合物的浓度；

(6)从母板中选取A610/A600比野生型HBP产量高的菌株进行测序，挑选有氨基酸变化的菌株进行摇瓶复筛；即将菌体诱导发酵后收集、洗涤，在5mL 反应体系中控制一定的菌体量以及一定量DBT作为全细胞催化底物；在27～35℃下震荡反应24小时后，取一定量反应液，用等体积乙酸乙酯萃取，用HPLC检测反应体系内各组分的含量；

(7)经上述步骤筛选到一株HBP产量最高的菌株E.coli BL21(DE₃)/A101V；结合Discovery Studio 3.0的模拟分子对接结果，发现A101是其中一个可能的结合口袋中的残基；

(8)通过引物A101-S/A101-A对DszC进行A101位氨基酸的饱和突变，获得的突变体分别表达纯化后，在一定浓度的HBP抑制作用下测量它们的酶活力；其中A101K酶活力最高；

(9)以A101K的核苷酸序列为模板，通过引物W327-S/W327-A对DszC进行迭代饱和突变；获得的突变体分别表达纯化后，在一定浓度的HBP抑制作用下测量它们的酶活力；其中A101K/W327C标记为AKWC，酶活力最高。

4.如权利要求3所述的单加氧酶DszC突变体的方法，其特征在于，步骤(3)、(6)所述震荡的速率为180～250rpm。

5.如权利要求3所述的单加氧酶DszC突变体的方法，其特征在于，步骤(3)、(6)所述种子液按0.8～1.2:90～120的体积比例接种到LB液体培养基。

6.如权利要求3所述的单加氧酶DszC突变体的方法，其特征在于，步骤(3)、(6)所述IPTG加入培养基后的浓度为0.1～0.5mM。

7.如权利要求1或2所述的单加氧酶DszC突变体制备高校脱硫剂中的应用。