[发明专利]一种单加氧酶DszC突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种单加氧酶DszC突变体，该单加氧酶DszC突变体对4S途径终产物HBP反馈抑制脱敏，该单加氧酶DszC突变体是将来源于Rhodococcuserythropolis IGTS8的DszC的第101位丙氨酸突变为赖氨酸，第327位色氨酸突变为半胱氨酸，氨基酸序列如SEQ NO:4所示。本发明还提供制备该单加氧酶DszC突变体的方法及该单加氧酶DszC突变体在制备高校脱硫剂中的应用。本发明的技术方案通过获得在HBP抑制下酶活性最高的DszC酶突变体AKWC，能够对4S途径终产物HBP反馈抑制脱敏，显著地脱硫效率。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种单加氧酶DszC突变体及其制备方法和应用。

背景技术

在微生物4S脱硫途径中，DszC酶是第一个参与反应的酶，将DBT两步加氧氧化成DBTO₂。DszA、DszB、DszC酶均受到代谢终产物HBP的抑制，其中DszC受到的抑制最严重。因此，解除HBP对DszC酶的抑制从而提高DszC酶的催化活性获得优选的DszC酶对于提高4S脱硫途径的脱硫效率有着至关重要的意义。

微生物脱硫的4S途径可特异性裂解加氢脱硫(HDS)后残留的难脱硫芳香族S-杂环化合物的C-S键而不损失其燃烧值。该途径的四种Dsz酶将模式化合物二苯并噻吩(DBT)转化为无硫化合物2-羟基联苯(HBP)。该途径最困难的瓶颈之一是HBP对Dsz酶的反馈抑制作用，并且4S途径中第一个参与反应的酶DszC受到最严重的抑制。

然而，目前关于HBP在DszC上的结合位点和结合机制尚未得到解析。在缺乏酶结构或催化机理信息的情况下，定向进化技术是提高酶催化活性的有力工具。因此，通过定向进化技术获得优选的DszC酶能够有效提高4S途径的脱硫效率。

发明内容

有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于克服现有技术中不足，提供一种单加氧酶DszC突变体，通过获得在HBP抑制下酶活性最高的DszC酶突变体AKWC，能够对4S途径终产物HBP反馈抑制脱敏，显著地脱硫效率。

本发明所解决的技术问题在于提供一种单加氧酶DszC突变体，通过高通量筛选和模拟分子对接获得了HBP产量最高的突变菌株E.coli BL21(DE3)/A101V，并对A101和一个与HBP通过π键相互作用的关键残基W327进行了迭代饱和诱变，最终获得了在HBP抑制下酶活性最高的DszC酶突变体AKWC。

为了达到上述技术效果，本发明提供了如下技术方案：

一种单加氧酶DszC突变体，该单加氧酶DszC突变体对4S途径终产物HBP反馈抑制脱敏，其特征在于：该单加氧酶DszC突变体是将来源于Rhodococcuserythropolis IGTS8的DszC的第101位丙氨酸突变为赖氨酸，第327位色氨酸突变为半胱氨酸，氨基酸序列如SEQNO:4所示。编码该DszC突变体的核苷酸序列如SEQ NO:3所示。

一种制备上述单加氧酶DszC突变体的方法，包括以下步骤：

(1)以SEQ NO:1所示的野生型DszC的核苷酸序列为模板，以其编码序列如SEQ NO:1的核苷酸序列为模板，通过易错PCR引物EP-S/EP-A、使用低保真DNA聚合酶rTaq酶和添加一定量的MnSO4对DszC进行随机突变；

(2)步骤(1)的突变基因和含有4S途径其余三个基因dszA、dszB和dszD的表达载体pSB4A5-BAD经Nhe I和HindⅢ双酶切、T4连接酶连接后转化表达宿主E.coli BL21(DE3)；