[发明专利]一种香豆素衍生物及其合成方法和应用

说明书

本发明提供了一种香豆素衍生物及其合成方法和在半胱氨酸检测中的应用，所述香豆素衍生物的中文名称为(E)‑7‑(二乙基氨基)‑3‑(3‑(4‑((7‑硝基苯并[c][1,2,5]恶二唑‑4‑基)氧基)苯基)丙烯酰基)‑2H‑吡喃‑2‑酮，英文名称为(E)‑7‑(diethylamino)‑3‑(3‑(4‑((7‑nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol‑4‑yl)oxy)phenyl)acryloyl)‑2H‑chromen‑2‑one，命名为CNS。本发明同时提供了一种超灵敏检测半胱氨酸的方法，该方法基于所述香豆素衍生物，在PBS/DMSO(v/v,9/1,pH＝7.4)溶液中通过荧光分光光度计检测半胱氨酸的含量。该方法实现了超灵敏简便检测半胱氨酸。

技术领域

本发明涉及香豆素衍生物，具体属于一种香豆素衍生物及其合成方法，以及该衍生物在超灵敏检测半胱氨酸中的应用。

背景技术

研究表明，半胱氨酸的来源途径之一是胱硫醚β-合酶(CBS)和胱硫醚γ-裂解酶(CSE)对同型半胱氨酸的硫转移；同时，半胱氨酸也可以通过γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)和谷氨酰胺合成酶(GS)的连续作用转化为谷胱甘肽。因此，作为细胞内活性硫物质的转运站，半胱氨酸在生物体中起着重要作用。半胱氨酸作为一种还原性物质，与维持氧化还原的稳态，蛋白质翻译和折叠，以及信号转导等生理过程方面有着紧密的联系。正常血浆中Cys的总浓度为250μM，细胞中半胱氨酸的总浓度为30～200μM。同时，研究表明，半胱氨酸浓度的异常往往与某些疾病有关，如心脑血管疾病，阿尔茨海默病，抑郁症，肠道损伤甚至癌症。

近年来，荧光探针因其设计选择性好、具有低细胞毒性、可原位检测等优异的性能而引起了许多人的关注，已成为生物医学发展中具有广阔前景的课题之一。

在本发明中，合成了一种基于香豆素的化合物，通过半胱氨酸和化合物在反应前后荧光信号的变化，实现半胱氨酸的超灵敏、特异性检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种香豆素衍生物及其合成方法，以及该衍生物在检测半胱氨酸中的应用，该衍生物用于检测半胱氨酸时检出限低，选择性好。

本发明提供的一种香豆素衍生物，中文名称为((E)-7-(二乙基氨基)-3-(3-(4-((7-硝基苯并[c][1,2,5]恶二唑-4-基)氧基)苯基)丙烯酰基)-2H-吡喃-2-酮，英文名称为(E)-7-(diethylamino)-3-(3-(4-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-yl)oxy)phenyl)acryloyl)-2H-chro men-2-one，命名为CNS。其结构式为：

CNS的合成方法，步骤为：

1)按摩尔比1:1～1.5将3-乙酰基-7-二乙基氨基-香豆素与对羟基苯甲醛在无水乙醇中搅拌溶解；加入催化量的哌啶，逐渐加热至回流，回流后搅拌该混合溶液12～24小时，待反应完全后，减压除去溶剂，经硅胶柱层析纯化，得到橙色粉末即化合物1；

2)将化合物1和NBD-Cl按摩尔比1:1～1.5一同溶解于无水乙醇中，随后加入催化量的TFA,常温下搅拌12～24小时，然后将反应溶液倒入冰水中，搅拌2～2.5小时，用适量的二氯甲烷萃取，收集有机相，干燥，减压除去溶剂后经硅胶柱层析纯化，得到橙色固体CNS。

作为优选：步骤1)中3-乙酰基-7-二乙基氨基-香豆素和对羟基苯甲醛的摩尔比为1:1.2。步骤2)中化合物1和NBD-Cl的摩尔比为1:1.1。

上述合成的香豆素衍生物CNS用于超灵敏检测半胱氨酸。

一种检测半胱氨酸的方法，包括如下步骤：

(1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM的半胱氨酸水溶液，配置2mM的CNS的DMSO溶液；