[发明专利]一种基于RGO-CS-Fc/Au NPs纳米复合材料结合适配体检测甲胎蛋白的方法

权利要求书

1.一种基于RGO-CS-Fc/Au NPs纳米复合材料结合适配体作为识别探针检测甲胎蛋白的方法，按以下步骤进行：

步骤1：RGO-CS-Fc复合纳米材料的制备

称取5mg GO，倒入于50 mL蒸馏水中，使用超声细胞破碎仪超声2h使其充分溶解均匀，制成 0.1 mg/mL的GO水溶液；

取10 mL GO水溶液，加入10mg AA使其还原GO，置于恒温数显磁力加热搅拌器上持续搅拌12h，即得RGO；

将2 mg CS加入100 mL 1%的乙酸溶液中，搅拌均匀，直至观察到溶液中无气泡，得到均一稳定的2.0 mg/mL CS溶液；

再称取2 mg Fc与10 mL壳聚糖混合，以10 mmol/L EDC/NHS活化，搅拌24 h，得到CS-Fc；

取10 mL RGO悬液加入到10 mL CS-Fc溶液中，以浓度为10 mmol/L 的EDC/NHS活化30min，20000 r/min离心分离，得到RGO-CS-Fc悬浊液；

步骤2：电极的修饰与生物传感界面的构建

SPE在使用前浸泡在0.5mol/L H₂SO₄ 溶液中进行CV扫描，在-0.4V ~1.2V的电压范围内扫描20段；扫描完成之后用水洗净，晾干，得到活化的SPE；

将活化SPE电极放入4mL 0.01%氯金酸溶液，在-0.5 V恒电位沉积120s，沉积完成后用纯水洗涤3次，吹干得到Au NPs/SPE电极；

将Au NPs/SPE电极用2.5%戊二醛浸泡15 min，用pH7.0 的PBS洗涤3次，吹干；滴加5μL的RGO-CS-Fc悬浊液孵育30 min，PBS洗涤3次，晾干，得RGO-CS-Fc/Au NPs/SPE；

取2μL氨基化的AFP适配体滴加于RGO-CS-Fc/Au NPs/SPE传感界面上，孵育3 h，洗涤未能固定到界面的适配体，滴加6μL 0.5%的BSA溶液进行封闭，晾干，得到AFP aptamer /RGO-CS-Fc/Au NPs/SPE传感界面；

步骤3：甲胎蛋白标准曲线的绘制

在AFP aptamer /RGO-CS-Fc/Au NPs/SPE传感界面滴加2 µL甲胎蛋白溶液，25℃温度下孵育30min，用pH 7.0 的PBS溶液和蒸馏水清洗，吹干，得到工作电极；

将工作电极放到浓度为0.2 mol/L、pH6.0的PBS支持液中，采用电化学工作站的DPV扫描，记录其峰电流；

不同AFP浓度的DPVAFP浓度在0.001~10 µg/mL范围内时，传感器电流响应值Y与AFP浓度X之间的关系呈线性，其线性回归方程为Y=7 .2106+2 .8699X，相关系数为0 .9856；

步骤4：实际血清样本中AFP的检测

将2μL已知浓度的AFP溶液滴加在AFP aptamer/ RGO-CS-Fc /Au NPs/SPE电极表面，同时将100μL人血清样品加入到 5 mL PBS 支持溶液中；按照步骤3，将工作电极置于PBS支持溶液中进行DPV扫描，记录电流值；根据步骤3标准曲线，得到待测实际样品中甲胎蛋白的浓度。