[发明专利]一种基于RGO-CS-Fc/Au NPs纳米复合材料结合适配体检测甲胎蛋白的方法

说明书

一种基于RGO‑CS‑Fc/Au NPs纳米复合材料结合适配体检测甲胎蛋白的方法，采用电沉积技术以及静电吸附作用将RGO‑CS‑Fc/Au NPs修饰在丝网印刷电极表面。通过纳米技术以及分子间作用力将AFP适配体负载在RGO‑CS‑Fc/Au NPs材料表面，适配体因其不稳定的空间结构而以单链结构的形式存在复合材料表面。在电极表面中加入AFP后，AFP能够与AFP适配体特异性结合，生成稳定的空间结构，从而可以有序的排列在电极表面。通过DPV方法检测电流值，并描绘出该电流与甲胎蛋白浓度的关系曲线，实现对甲胎蛋白的定量检测。该方法操作简单、省时、费用低且具有较低的检测限。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于纳米复合材料结合适配体来检测甲胎蛋白的方法。

背景技术

甲胎蛋白（AFP）是属于白蛋白家族中的一种酸性糖蛋白，它是由500多个氨基酸残基形成的单多肽链。对于正常成年人来说，AFP在人体内的含量极低。AFP检测方法主要有放射免疫分析法、荧光免疫分析法、酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析法、流式免疫分析法、电化学免疫传感器、压电免疫传感器及多肽复合蛋白微阵列等。公开号CN 104677889 B的发明专利，涉及一种基于鲁米诺功能化的磁性免疫探针检测甲胎蛋白的方法。利用鲁米诺功能化的磁性微球标记甲胎蛋白二抗，从而制得鲁米诺功能化的磁性免疫探针。在金电极表面构建“甲胎蛋白一抗/甲胎蛋白抗原/鲁米诺功能化的磁性免疫探针”式复合结构，通过检测电致化学发光信号实现对甲胎蛋白的灵敏、特异性检测。公开号CN 105823886 B的发明专利，涉及一种二茂铁二甲酸/铂纳米粒/DNA酶复合物制备及其检测甲胎蛋白的方法。申请号为CN104569435B的发明专利，公开了一种无标记光电化学甲胎蛋白免疫传感器的制备方法，在二氧化钛纳米颗粒基底上，利用光电化学合成方法，制备枝晶纳米棒状的三金属合金纳米材料，进而制得了检测甲胎蛋白的无标记光电化学免疫传感器。这些方法所用仪器昂贵、操作复杂、费时且技术要求高，需要建立一种快速、灵敏、操作简便的AFP检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于还原性氧化石墨烯-壳聚糖-二茂铁/纳米金（RGO-CS-Fc/Au NPs）的纳米复合材料结合适配体来检测甲胎蛋白的方法，提高灵敏度、增强特异性。

为了解决该技术问题，采用电沉积技术以及静电吸附作用制作了基于RGO-CS-Fc/Au NPs的AFP纳米适配体电化学生物传感器。利用石墨烯及纳米金属对AFP适配体的高负载能力和良好的电子传递效应，以及AFP适配体对AFP的特异性识别作用，采用电化学工作站的微分脉冲伏安法 (DPV)，记录其峰电流。对AFP的孵育温度、孵育时间、PBS的pH值和AFP适配体浓度进行了优化，绘制了标准曲线，通过与标准工作曲线对比得到准确的AFP浓度。与现有的方法相比，操作相对简单，特异性高，时间和费用的消耗更少，能达到1.013 ng/mL的检测限。

本发明的检测原理为：采用电沉积技术以及静电吸附作用将RGO-CS-Fc/Au NPs修饰在丝网印刷电极表面。通过纳米技术以及分子间作用力将AFP适配体负载在RGO-CS-Fc/Au NPs材料表面，适配体因其不稳定的空间结构而以单链结构的形式存在生物传感界面。在生物传感界面上加入AFP后，AFP能够与AFP适配体特异性结合，生成稳定的空间结构，从而可以有序的排列在电极表面。通过DPV方法检测AFP前后在的PBS溶液（0.2 mol/L，pH6.0）中的电化学信号（扫描速率为0.01V/s，扫描的电压区间是 -0.4V-1.2V），并描绘出该电流与AFP浓度的关系曲线，从而实现对AFP的检测。

本发明按照以下步骤进行：

步骤1：RGO-CS-Fc材料的制备

(1)还原性氧化石墨烯（RGO）的制备：氧化石墨烯（GO）倒入蒸馏水中，使用超声细胞破碎仪超声，使其充分溶解均匀，制成GO水溶液。取上述GO水溶液置于烧杯中，加入抗坏血酸（AA）使其还原GO，得RGO。