[发明专利]一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用

说明书

本发明提供一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用。本发明中将修复酶的特异性与末端脱氧核苷酸转移酶介导的聚合延伸相结合，以启动核酸内切酶IV诱导的循环切割信号探针，诱导Endo IV裂解信号探针中的AP位点，导致信号探针上AF488荧光团的释放，同时产生具有游离3'‑OH末端的信号探针。具有游离3'‑OH的每个信号探针可以通过TdT有效地延长以产生长的poly‑A序列。释放的poly‑A序列和新产生的poly‑A序列可以诱导信号探针的多次循环切割，释放出更多的AF488荧光团。在磁力分离下，上清液中的荧光团可以通过单分子成像定量。具有良好的实际应用之价值。

技术领域

本发明属于生物检测和分子生物学技术领域，具体涉及一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

端粒由双链的重复序列(TTAGGG)n组成且具有单链的突出末端。端粒封闭真核染色体的末端并在基因组的稳定性和细胞活力中发挥关键作用。TTAGGG重复序列的富含G的特性使端粒极易受氧化损伤，特别是在单链区域，因为它更容易与氧化剂反应。氧化性损伤8-oxoG和FapyG是脱氧鸟苷(dG)最常见的氧化产物，可以通过引起复制错误和转录干扰诱导遗传毒性。端粒中富含的G碱基有助于氧化应激过程中G氧化性损伤的优先积累，而且它的修复效率比基因组中其他序列中的G损伤偏低。端粒的氧化损伤与端粒长度和完整性的变化有关，这将导致多种疾病的发生，如心血管疾病，糖尿病和癌症。因此，检测端粒中的氧化损伤水平将为分子医学，早期诊断和化学品的遗传毒性提供巨大益处。

目前，检测基因组中8-oxoG的最常用方法包括高效液相色谱(HPLC)与电化学检测相结合(HPLC-ECD)以及HPLC与气相色谱-质谱联用(HPLC-MS)/MS)。这些方法可以提供更准确的8-oxoG计数，但需要把DNA序列消化成单个核苷酸碱基，而且需要复杂的仪器设备及繁琐的实验步骤。迄今为止，由于低丰度和高度重复的基因区域，很少有方法可用于检测端粒中的氧化性损伤水平。最近，纳米孔技术和基于定量PCR(q-PCR)的方法可以用于检测人端粒序列中的氧化性损伤。然而，发明人发现，它们需要特定的损伤标记和复杂的热循环仪来精确控制热循环。利用腺苷的衍生物三磷酸Adap可用于区分人端粒序列中的8-oxoG损伤和正常的G碱基，但是该方法难以定量8-oxoG损伤。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用。本发明中将修复酶的特异性与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的聚合延伸相结合，以启动核酸内切酶IV(Endo IV)诱导的循环切割信号探针，诱导EndoIV裂解信号探针中的AP位点，导致信号探针上AF488荧光团的释放，同时产生具有游离3'-OH末端的信号探针。具有游离3'-OH的每个信号探针可以通过TdT有效地延长以产生长的poly-A序列。释放的poly-A序列和新产生的poly-A序列可以诱导信号探针的多次循环切割，释放出更多的AF488荧光团。在磁力分离下，上清液中的荧光团可以通过单分子成像定量。本发明无需复杂的仪器或繁琐的程序，同时检测灵敏度高，具有良好的实际应用之价值。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个方面，提供一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器至少包括信号探针、捕获探针和辅助探针。

其中，所述信号探针为具有脱嘌呤嘧啶位点(AP位点)的富T单链DNA序列，所述信号探针5'端修饰有生物素，所述信号探针3'端修饰有荧光基团，优选使用AF488进行修饰；

进一步的，所述信号探针与链霉抗生物素蛋白包被的磁珠进行缀合。

所述捕获探针用于捕获富集端粒，其具有与端粒杂交的单链DNA序列，所述捕获探针3'端进行生物素化修饰；