[发明专利]抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株HIRRV‑G‑4D10，保藏号为：CCTCC NO：C201869，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2018年3月29日的杂交瘤细胞分泌的。所述单抗经间接酶联免疫反应实验证明能与浓缩的病毒发生特异性结合，微量病毒中和测定实验结果显示，单抗HIRRV‑G‑4D10对HIRRV具有中和活性，可显著降低感染牙鲆弹状病毒的EPC细胞的病变效应。免疫印迹结合质谱分析结果显示：本发明的单抗能特异性识别60 kDa的天然牙鲆弹状病毒G蛋白。间接免疫荧光显示，单抗HIRRV‑G‑4D10可与感染牙鲆弹状病毒的EPC细胞发生特异性反应，荧光信号主要分布在细胞膜和细胞质中。本发明的单克隆抗体可用于制备抗牙鲆弹状病毒的免疫制剂和牙鲆弹状病毒的检测试剂。

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体及其制备方法，具体涉及一种具有中和活性的抗牙鲆弹状病毒的单克隆抗体及其制备方法与应用，属于免疫学和病毒学交叉技术领域。

背景技术

牙鲆弹状病毒（HIRRV）是水产养殖鱼类一种重要的病毒性病原，具有强烈的致病性，该病毒可感染牙鲆、香鱼、石鲽、鲈、河鳟等多种海淡水经济鱼类。当水温在10℃左右时该病容易暴发流行，可引起感染鱼体较高的死亡率，对水产鱼类的健康养殖产生严重的威胁。因此，研制特异性识别HIRRV的单克隆抗体可应用于疾病的快速诊断检测、致病机制研究以及抗病生物分子的开发等方面，具有重要的理论与实际应用价值。牙鲆弹状病毒基因组由一条单链负义RNA组成，可编码5种结构蛋白，分别为核蛋白(N)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，糖蛋白(G)，和RNA聚合酶(L)。其中，G蛋白是组成牙鲆弹状病毒的主要结构蛋白，在病毒表面形成三聚体，它与细胞膜受体结合并介导病毒入胞。该蛋白含有多个抗原位点，具有很强的抗原性，可诱导鱼体产生中和抗体。

因而，以牙鲆弹状病毒G蛋白为靶抗原，研制其特异性单抗，对于筛选病毒中和性单抗及研究HIRRV侵染机制具有更为重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种具病毒中和活性的抗牙鲆弹状病毒单克隆抗体及其制备方法。

本发明的目的是由以下技术方案实现的：一种抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株HIRRV-G-4D10，保藏号为：CCTCC NO：C201869，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为：2018年3月29日的杂交瘤细胞分泌的。

与所述的单克隆抗体发生特异性结合的抗原决定簇位于牙鲆弹状病毒G基因片段（61-1524 nt）基因编码的多肽区域。

一种所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：首先，利用Trizol法提取弹状病毒总RNA反转后获得cDNA，以cDNA产物为模板，PCR扩增G基因片段（61-1524 nt），连接pET-28a载体构建重组表达质粒pET-28a-G，将其导入感受态大肠杆菌后经诱导表达、亲和层析纯化获得重组G蛋白，以亲和纯化的重组G蛋白作为抗原免疫Balb/c小白鼠，采用细胞融合法制备杂交瘤细胞，通过微量中和实验和免疫学检测筛选方法，筛选到分泌具有病毒中和活性的抗牙鲆弹状病毒G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株HIRRV-G-4D10，采用常规方法扩大培养上述所得到的杂交瘤细胞株，收集细胞培养上清液，经纯化后得到抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体。

所述的免疫学检测筛选方法是：间接酶联免疫法，转印免疫印迹法和间接免疫荧光法。其中所述的间接酶联免疫法和转印免疫印迹法综合确定该单抗与牙鲆弹状病毒G蛋白特异性结合反应真实存在；所述的转印免疫印迹法确定该单抗的抗原决定簇位于牙鲆G基因片段（61-1524 nt）基因编码的多肽区域。