[发明专利]一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法及应用

权利要求书

1.一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，构建人His-FXR质粒；

步骤2，突变分组：将步骤1中的人His-FXR质粒分为五组，前四组分别依次突变人His-FXR质粒的锌指结构Cys138/141、Cys155/158、Cys174/180、Cys189/192位点，记为M1、M2、M3、M4，第五组突变人His-FXR质粒的锌指结构Cys138/141、Cys155/158、Cys174/180、Cys189/192的全部位点，记为M1-4；

步骤3，将步骤2突变后的五组人His-FXR质粒M1、M2、M3、M4、M1-4，分别加入293A细胞处理24h，随后再加入100 μM NaHS处理2h，得到细胞处理液；

步骤4，将经步骤3处理后的细胞处理液进行胞浆胞核蛋白分离，随后采用Westernblotting方法观察FXR表达情况；在步骤3收细胞前2h加入100μM NaHS，HEN Buffer收细胞并超声裂解，随后通过改良生物素转换实验检测FXR硫氢化修饰，得到初步FXR蛋白硫氢化修饰位点为：Cys138/141；

步骤5，对步骤4得到的初步FXR蛋白硫氢化修饰位点，通过锌离子荧光强度实验进行验证，确定FXR蛋白硫氢化修饰位点为：Cys138/141。

2.根据权利要求1所述的一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，其特征在于，所述步骤4中Western blotting方法具体为：

步骤4.1，电泳：将步骤3的细胞处理液接通电源，电压强度浓缩胶为4-5V/cm，分离胶为6-7V/cm；

步骤4.2，转膜：在电转槽中加入电转液，同时将硝酸纤维素膜和滤纸放入电转液中完全浸湿；将胶卸下，只保留目的片段胶，按顺序铺好滤纸、胶和膜；将用滤纸和膜夹好的胶平铺于海绵上，封紧后放入电转槽，在250mA电转2h；

步骤4.3，封闭：将步骤4.2的膜从电转槽中取出，使用TBST洗掉膜上残留的电转液，先用丽春红染色观察蛋白条带，再用去离子水和TBST将丽春红洗脱后再浸没于封闭液中，室温缓慢摇动1小时；

步骤4.4，孵育一抗：将经步骤4.3处理的膜从封闭液中取出，用滤纸吸干液体，放入孵育袋内，加入用封闭液稀释的一抗工作液FXR，室温下轻摇孵育1小时或在4ºC孵育8-16h，一抗孵育结束后，在摇床上用TBST洗膜3次，每次10分钟；

步骤4.5，孵育二抗：选择二抗兔抗，用封闭液按1:30000稀释，室温孵育1h；二抗孵育结束后，在摇床上用TBST洗膜3次，每次10分钟，准备发光；

步骤4.6，发光：将经步骤4.5处理后的膜使用去离子水漂洗，用滤纸吸干水分，正面朝下覆于发光液上，孵育1～5分钟后置于保鲜膜内固定于片盒中，曝光、显影、定影，清水冲净晾干，标定marker，进行分析或扫描。

3.根据权利要求1所述的一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，其特征在于，所述步骤5中锌离子荧光强度实验的具体步骤为：

步骤5.1，将293A细胞接种至10cm细胞培养皿，当密度为80%左右时加10μgFXR质粒过表达FXR，用试剂盒提取细胞核蛋白；

步骤5.2，分组：将细胞核蛋白分为四组，分别为control组、NaHS组、DTT组和NaHS+DTT组，其中每组为100μl细胞核蛋白，NaHS组通过NaHS 100 μM在37℃处理30min，DTT组通过DTT在37℃处理30min，NaHS+DTT组为依次使用NaHS 100 μM、DTT 1 mM在37℃处理30min；

分组：将细胞核蛋白分为六组，分别为FXR质粒组、M1组、M2组和、M3组、M4组和M1-4组，其中每组为100μl细胞核蛋白，依次加入FXR质粒、FXR锌指结构M1、M2、M3、M4和M1-4继续培养36小时；

每组100μl核蛋白分别用NaHS 100 μM，DTT 1 mM 37℃处理30min，或加FXR及FXR锌指结构不同位点突变质粒继续培养36小时；

步骤5.3，用15μM锌离子和25μM锌离子荧光探针继续孵育30min；

步骤5.4，脱盐柱洗脱多余的锌离子；

步骤5.5，酶标仪检测锌离子荧光强度。

4.FXR蛋白硫氢化修饰Cys138/141位点在缓解非酒精性脂肪肝生物制药中的应用。