[发明专利]一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法及应用

说明书

本发明公开的一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法及应用。在高脂饮食小鼠制备的脂肪肝模型上，通过形态学和Western blotting方法证实硫化氢通过代谢性核受体FXR缓解脂肪肝。在293A细胞转染人His‑FXR质粒及FXR锌指结构半胱氨酸突变质粒，并给予硫化氢供体处理，通过改良生物素转换实验和锌离子荧光强度实验检测并验证FXR硫氢化修饰，并确定修饰位点，发现硫化氢可使肝脏FXR Cys138/141位点发生硫氢化修饰，增强FXR对肝脏脂质合成关键酶转录调控能力，最终减轻肝脏脂质蓄积。本发明准确得到FXR蛋白硫氢化修饰位点，为缓解非酒精性脂肪肝疾病提供了新途径。

技术领域

本发明属于生物科学技术领域，具体涉及一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，本发明还涉及一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的应用。

背景技术

随着人们饮食结构和生活方式的改变，非酒精性脂肪肝已成为不可忽视的慢性肝病，除了过多的脂质摄入、糖脂代谢紊乱及HCV感染外，氨基酸特别是蛋氨酸代谢异常也是非酒精性脂肪肝发病的重要原因。

蛋氨酸是人体必需氨基酸也是体内重要的甲基供体，在体内蛋氨酸脱甲基后生成S-腺苷蛋氨酸，进而代谢生成同型半胱氨酸；其中50％的同型半胱氨酸再甲基化成蛋氨酸(称为蛋氨酸循环)，其余的同型半胱氨酸在胱硫醚β合酶(cystathionineβ-synthase，CBS)催化下产生胱硫醚，再经胱硫醚γ裂解酶(cystathionineγ-lyase，CSE)催化产生半胱氨酸，并释放硫化氢气体，半胱氨酸最终代谢成丙酮酸进入三羧酸循环，而硫化氢则代谢成硫酸盐及硫代硫酸盐。

内源性H₂S是蛋氨酸代谢的中间产物，依赖于胱硫醚β合酶及胱硫醚γ裂解酶催化产生，被认为是一种新型气体信号分子。肝脏是H₂S产生最多的器官之一，其内源性生成关键酶胱硫醚β合酶和胱硫醚γ裂解酶，在肝细胞中表现出高表达。在啮齿类动物肝脏中胱硫醚γ裂解酶蛋白量超过胱硫醚β合酶蛋白量的近60倍，肝脏90％中的H₂S由CSE催化产生。

FXR(farnesoid X receptor)属于类固醇激素核受体家族，当配体与FXR配体结合区结合后，FXR空间结构发生变化，与视黄酸X受体以异二聚体形式结合于靶基因启动子区的FXRE(FXR response element，FXRE)来调控基因的表达。FXR蛋白结构DNA结合区中通常包含两个高度保守的富含半胱氨酸残基的锌指结构。晶体结构分析显示，锌指结构有利于DBD特异性序列与DNA双螺旋大沟结合，增强核受体转录活性。FXR对靶基因的调控通路复杂，不仅调控胆汁酸代谢，还可通过调节糖、脂代谢，缓解非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。

蛋白质是细胞功能的最重要执行者，其决定着生命活动能否有序、高效的进行，而其中翻译后修饰(Post-translational modification，缩写为PTM)起着重要的调节作用。翻译后修饰改变了蛋白质中不同氨基酸残基上的生物化学官能团，进而改变其化学性质或结构，使得蛋白质具有更为复杂的结构和更为完善的功能，实现更为精细的调节。蛋白质的翻译后修饰过程极其复杂，已知的翻译后修饰种类有20多种，其中较为常见的主要是磷酸化、泛素化、SUMO化、酰(含乙酰)化、甲基化以及糖基化。H₂S可使蛋白质发生另一种转录后硫氢化修饰，硫氢化修饰是指蛋白质特定位点的半胱氨酸-SH基团转变为-SSH基团，经修饰后的蛋白活性可发生改变。