[发明专利]一种高纯血清白蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种高纯血清白蛋白的制备方法，其特征在于：

所述方法采用血清为原料，采用盐析酸沉淀分离法对血清进行粗纯化，获得粗纯化后的血清白蛋白，粗纯化后的血清白蛋白进行层析分离获得高纯血清白蛋白；

所述粗纯化后的步骤具体包括：

第一步、粗纯化血清白蛋白溶液更换为血清白蛋白层析缓冲液：所述缓冲液换液方法，具体为将粗纯化后的血清白蛋白溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤换液，更换为离子交换层析上样缓冲液或亲和层析上样缓冲液，层析缓冲液换液量为5-20个血清白蛋白溶液体积，换液完成后获得含有血清白蛋白的离子交换层析上样溶液或亲和层析上样溶液；

第二步、对含有血清白蛋白的离子交换层析上样溶液或亲和层析上样溶液进行层析分离，根据紫外吸收峰收集洗脱液(含有纯化的血清白蛋白)，并更换为血清白蛋白保存缓冲液；

第三步、血清白蛋白的病毒灭活，向纯化的血清白蛋白中加入白蛋白稳定剂-辛酸钠，进行巴氏消毒法灭活病毒处理，即为制备的高纯度血清白蛋白；

所述辛酸钠的添加量为0.16～0.18mmol/g蛋白质；将添加了辛酸钠的层析纯化的白蛋白溶液装于密封容器中，放入60±1℃的水浴中，保温灭活处理10h，即为灭活了病毒的高纯血清白蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种高纯血清白蛋白的制备方法，其特征在于，在第一步中粗纯化血清白蛋白溶液通过超滤的方法更换为血清白蛋白离子交换层析上样缓冲液，并获得离子交换层析上样溶液；

所述第二步具体包括如下步骤：

第二步之一、在层析柱中加入离子层析介质，所述离子层析介质为阴离子层析介质，包括DEAE为配基和Q为配基的层析介质，所述DEAE为N,N-二乙基氨基乙基，diethylaminoethyl，所述Q为N,N-二乙基氨基-2-羟丙基；

第二步之二、加入层析缓冲液平衡层析柱；

第二步之三、将含有血清白蛋白的离子交换层析上样溶液通过层析仪进入层析柱中，控制流速为1mL/min，监测蛋白质紫外吸收峰；

第二步之四、上样完毕后，更换为冲洗缓冲液，进一步去除非特异性结合的杂蛋白，并冲洗至蛋白质紫外吸收峰下降至基线；

第二步之五、冲洗完毕后，更换为洗脱缓冲液，洗脱层析介质结合的血清白蛋白，并收集洗脱的目的蛋白，即为层析纯化的血清白蛋白溶液；

第二步之六、将层析纯化的血清白蛋白洗脱溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤并更换为血清白蛋白保存缓冲液，换液量为5-20个血清白蛋白溶液体体积，并浓缩至血清白蛋白含量为98-102mg/mL。

3.根据权利要求2所述的一种高纯血清白蛋白的制备方法，其特征在于：

所述离子交换层析上样缓冲液为20mM的磷酸盐和80mM的NaCl的磷酸盐缓冲液；

所述冲洗缓冲液为20mM的PBS+150mM的NaCl缓冲液，pH值为6-8；

所述洗脱缓冲液为20mM的PBS+1M的NaCl缓冲液，pH值为6-8；

所述血清白蛋白保存缓冲液为150mM的NaCl溶液。

4.根据权利要求1所述的一种高纯血清白蛋白的制备方法，其特征在于，在第一步中通过超滤的方法将粗纯化血清白蛋白溶液更换为亲和层析上样缓冲液，并获得亲和层析上样溶液；

所述第二步具体包括如下步骤：

第二步之一、在层析柱中加入亲和层析介质，所述亲合层析介质为对白蛋白具有亲和作用的蓝色染料作为亲和配基，具体为Blue-sepharose FF；

第二步之二、加入5倍柱体积的层析缓冲液平衡层析柱；

第二步之三、将含有血清白蛋白的亲和层析上样溶液通过层析仪进入层析柱中，控制流速为1mL/min，监测蛋白质紫外吸收峰；

第二步之四、上样完毕后，继续用亲和层析上样缓冲液，冲洗至蛋白质紫外吸收峰下降至基线；

第二步之五、冲洗完毕后，更换为洗脱缓冲液，洗脱层析介质结合的血清白蛋白，并收集洗脱的目的蛋白，即为层析纯化的血清白蛋白溶液；

第二步之六、将层析纯化的血清白蛋白洗脱溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，并更换为血清白蛋白保存缓冲液，换液量为5-20个血清白蛋白溶液体体积，并浓缩至血清白蛋白含量为98-102mg/mL。