[发明专利]鹅细小病毒VP3蛋白抗原ELISA检测试剂盒及检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种鹅细小病毒VP3蛋白抗原ELISA检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒中包括：包被鹅细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、纯化的鹅细小病毒VP3重组蛋白抗原标准品、HRP标记的抗鹅细小病毒VP3单克隆抗体、洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液、终止液以及抗原标准品。同时，本发明还公开了一种采用所述试剂盒准确定量检测样品中的鹅细小病毒VP3蛋白抗原的方法。本发明的试剂盒除具有ELISA试剂盒的优点外，还克服了抗原空间构象问题所致的特异性低和二抗问题所致的灵敏度等缺陷，显著提高了检测的特异性和灵敏度。

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种鹅细小病毒VP3蛋白抗原ELISA检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

鹅细小病毒，即小鹅瘟病毒，鹅细小病毒感染是由鹅细小病毒引起的一种高度接触性、急性、败血性传染病，主要侵害4-20日龄雏鹅和雏番鸭。雏鹅和雏番鸭以精神萎顿、食欲废绝和严重腹泻为特征性临床症状，以渗出性肠炎、全身急性败血病变为特征，小肠最后段狭窄处肠腔有栓子状物堵塞肠腔为剖解症状。目前，此病每年都有不同程度地流行，仍为养鹅业和集约化养殖番鸭的国家中最主要的传染病之一，对水禽养殖业造成严重损失。

目前虽然有不少的检测方法，例如琼脂扩散试验和琼脂扩散抑制试验，中和试验和动物保护试验，直接免疫荧光诊断法，免疫酶斑点法，但是尽管这些方法可以检测GPV，但存在操作繁琐，使用不方便，耗时长以及不易普及等缺陷。现有技术中，CN104833801B公开了一种检测小鹅瘟抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒，该试剂盒采用双单抗结合技术检测GPV抗原，所述试剂盒至今未能市场化，且所述试剂盒制备程序繁琐，仅能定性检测小鹅瘟抗原的存在，不能满足针对疫苗产品中抗原含量的检测。为此急需研究一种高效、精准且定量检测GPV的方法。

发明内容

本发明为了提高检测的特异性和灵敏度，同时又能够满足针对样品中小鹅瘟VP3蛋白的定性和定量检测，提供了一种检测鹅细小病毒VP3蛋白抗原ELISA检测试剂盒，并提供了其检测方法和应用。

第一方面，本发明的目的在于提供一种鹅细小病毒VP3蛋白抗原ELISA测试剂盒。其中，所述试剂盒包含：包被鹅细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、纯化的鹅细小病毒VP3重组蛋白抗原标准品、HRP标记的抗鹅细小病毒VP3单克隆抗体、洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液以及终止液。其中，所述抗原标准品为纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒(VLPs)的鹅细小病毒VP3蛋白，所述酶底物A溶液含有双氧水的乙酸钠缓冲溶液、酶底物B溶液为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液。

本发明的优选方案中，所述的鹅细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体为ProteinA柱纯化重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒(VLPs)的鹅细小病毒VP3蛋白作为抗原免疫实验兔后获得的高价血清所得，所述鹅细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体的包被量为0.01μg-0.5μg/孔。包被稀释液为pH为9.6的0.05ml/L的碳酸盐缓冲液。组成为每升碳酸盐缓冲液中含有1.59gNa₂CO₃和2.93g NaHCO₃。

本发明的优选方案中，所述封闭液选自质量浓度为1-10％的牛血清自蛋白(BSA)或质量浓度为1-10％的脱脂奶粉的任一或其组合。

本发明的优选方案中，样品稀释液由质量浓度为0.1-10％BSA和含有0.01-1％ProClin 300的磷酸盐缓冲液组成，其中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。

本发明的优选方案中，所述样品稀释液的配制为：现配制pH7.2-7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，121℃20min高压灭菌冷却后加入0.1-10％BSA和含有0.01-1％ProClin 300，即得。