[发明专利]鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法

权利要求书

1.鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：建立泰乐菌素对鸡毒支原体的耐药检测方法：以金黄色葡萄球菌ATCC29213作为质控菌株，泰乐菌素作为质控药物，测定泰乐菌素对临床分离鸡毒支原体的MIC；

步骤二：制定泰乐菌素对鸡毒支原体的野生型临界值(CO_WT)：首先从临床感染鸡只中分离获取出鸡毒支原体107株，与实验室保存的标准菌株4株组成共111株鸡毒支原体，然后采用肉汤稀释法测定了泰乐菌素对111株鸡毒支原体的MIC值，将得到的MIC数据带入Ecoffinder软件，进行非线性回归模拟，得到不同置信区间下的野生型临界值；

步骤三：制定泰乐菌素对鸡毒支原体的药效学临界值(CO_PD)：选取了MIC₉₀的菌株进行鸡胚毒力试验，选择SPF级鸡胚进行鸡胚感染试验，将鸡胚孵化至7日龄，在强光照下找到鸡胚的胚胎并标记其与气室的位置，选择卵黄囊接种方法，接种剂量为10⁶CCU，每日观察鸡胚情况，记录每日鸡胚死亡数量，最终选择M17菌株进行PK-PD试验，制定药效学临界值，将得到的PK-PD数据利用Crystalball7软件进行蒙特卡洛模拟得到药动学靶值在不同MIC下的达标率，选取达标率在90％以上所对应的最大MIC值为药效学临界值；

步骤四：制定泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值(CO_CL)：选取了5个不同的MIC的菌株进行鸡胚毒力试验，选择SPF级鸡胚进行对鸡毒支原体的毒力鉴定，将鸡胚孵化至7日龄，在强光照下找到鸡胚的胚胎并标记其与气室的位置，试验选择卵黄囊接种方法，接种剂量为10⁶CCU，每日观察鸡胚情况，记录每日鸡胚死亡数量，最终选择最高峰值MIC、最高峰值MIC左右的、野生型临界值、MIC₅₀、MIC₉₀的5个不同MIC的菌株进行临床治疗试验，制定泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值，临床试验制定的临床临界值可通过“WindoW”计算、非线性回归和二分树(CART)分析方式进行验证；

步骤五：根据泰乐菌素对鸡毒支原体的野生型临界值、泰乐菌素对鸡毒支原体的药效学临界值和泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值，利用折点制定流程图来制定最终的折点，得出鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准；

所述步骤三中鸡胚毒力试验具体过程为：择SPF级鸡胚进行鸡胚感染试验，将鸡胚孵化至7日龄，在强光照下找到鸡胚的胚胎并标记其与气室的位置，在无菌操作台进行试验，用75％的医用酒精消毒鸡蛋表面，过程中不可擦掉胚胎和气囊标记，试验选择卵黄囊接种，接种剂量为10⁶CCU，接种方法为：气室端蛋壳消毒后，在气室中央打一小孔，用7号注射器针头垂直刺入3cm，注射接种菌液0.2mL，石蜡封口，继续在37℃孵化，每天翻蛋2次；

所述步骤四中制定泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值时，根据MIC分布范围，选择具有致病力的鸡毒支原体，选择依据：最高峰值MIC、最高峰值MIC左右的、野生型临界值、MIC₅₀、MIC₉₀的MIC的菌株，根据具体MIC分布综合考虑选择5个MIC菌株；

所述步骤四中菌株的致病力试验是通过鸡胚感染模型试验进行验证，将对数生长期对应菌液通过卵黄囊注射接种于鸡胚，每个鸡胚接种0.3mL同样浓度的菌液，同时以无菌空白肉汤腹腔注射鸡胚作为空白对照组，观察鸡胚死亡情况，选择死亡率高的菌株；

所述步骤四中临床试验得到的临床临界值可带入“WindoW”算法、SPSS软件中的非线性回归和SalfordPredictiveModeler软件的二分树(CART)分析进行验证，首先用“WindoW”方法对临床疗效的结果进行分析，测定其参数值MaxDiff和CAR，根据参数值确定临床临界值范围，再根据EUCAST提议的POC与MIC之间的公式，利用SPSS软件中的非线性回归对其所得数据进行拟合，以Log₂MIC为自变量，POC为因变量，得到相关系数最高的模型表达式来确定临床临界值范围，最后再将临床试验数据带入SalfordPredictiveModeler软件中，以MIC为预测变量，POC为目标变量，进行二分树(CART)分析来确定临床临界值的范围。