[发明专利]猪源沙门氏菌对安普霉素的耐药判定标准试验方法

权利要求书

1.猪源沙门氏菌对安普霉素的耐药判定标准试验方法，其特征在于，所述方法为非诊断和非治疗目的，包括以下步骤：

步骤一：制定安普霉素对猪源沙门氏菌的野生型临界值：对沙门氏菌进行invA基因的PCR鉴定，然后采用琼脂稀释法测定安普霉素对沙门氏菌的MIC，整理分析得到的MIC数据，用Ecoffinder软件模拟，制定出安普霉素对猪源沙门氏菌的野生型临界值；

步骤二：制定安普霉素对猪源沙门氏菌药效学临界值：对沙门氏菌进行毒力基因检测，筛选出含有毒力基因较多、毒力较强的菌株，然后进行小鼠毒力实验，最后筛选出MIC值在MIC₅₀、MIC₉₀、野生型临界值及其附近的致病性较强的菌株，选择MIC₅₀ 10#菌株进行PK-PD实验，制定出安普霉素对猪源沙门氏菌药效学临界值；

步骤三：制定安普霉素对猪源沙门氏菌用药方案，根据步骤二中制定出的安普霉素对猪源沙门氏菌药效学临界值，再通过剂量方程，计算得到预防、治疗和根除的安普霉素给药剂量，然后根据群体混饲给药方程计算出安普霉素混饲的预防、治疗和根除剂量；

步骤四：制定安普霉素对猪源沙门氏菌临床临界值：选择试验仔猪进行分组，分成空白组、阴性对照组和通过毒力实验筛选出的不同MIC组，空白组、阴性对照组和通过毒力实验筛选出的不同MIC组的组数比例为1:1:5，空白组、阴性对照组和通过毒力实验筛选出的不同MIC组的试验仔猪数量比例为1:2:2，然后根据步骤三中得到的群体混饲给药方程计算出安普霉素混饲的预防、治疗和根除剂量，对仔猪进行试验，通过临床症状评分和实时活菌菌落计数，统计临床治愈率，然后使用“WindoW”法分析计算MaxDiff和CAR，得出临床临界值的选择窗，再使用CART回归树分析出临床临界值的范围；

步骤五：根据步骤一中制定出的安普霉素对猪源沙门氏菌的野生型临界值、步骤二中制定出的安普霉素对猪源沙门氏菌药效学临界值以及步骤四中制定出的安普霉素对猪源沙门氏菌临床临界值，参考CLSI的折点制定流程图，当药效学临界值＞野生型临界值＞临床临界值时耐药折点值等于野生型临界值，确定出最终的安普霉素对沙门氏菌的耐药判定标准；

所述步骤一中用Ecoffinder软件模拟，制定出安普霉素对猪源沙门氏菌的野生型临界值时，先将所得MIC数据输入Ecoffinder软件，设置初始数量为140，Log₂MIC_mean为2，Log₂MIC_SD为1，取置信区间为95％或97 .5％的ECOFFs值为最终的野生型临界值；

所述步骤二中制定安普霉素对猪源沙门氏菌药效学临界值时，使用Winnonlin软件模拟获得6头猪血浆和回肠内容物中的药动学参数AUC，计算平均值和标准差，然后根据计算结果使用CrystalBall软件进行蒙特卡洛模拟10000头猪的AUC₂₄，通过半体内杀菌曲线给出的不同杀菌作用下的药效学目标，分别计算不同药效学目标下、不同MIC时AUC₂₄/MIC达到药效学目标的概率，得出不同杀菌作用下达标率大于等于90％的最大MIC即为药效学临界值；

所述步骤三中制定安普霉素对猪源沙门氏菌用药方案时，利用PK-PD参数折点值计算给药剂量，计算公式如公式(1)所示：

其中，CL指安普霉素在猪消化道中清除率；(AUC/MIC)_BP指对应不同治疗效应的PK/PD参数折点值；MIC为临床沙门氏菌的MIC；F为生物利用度；fu为游离药物浓度比例；

给药剂量确定后，应用Mlxplore软件模拟不同给药剂量和给药间隔下沙门氏菌的生长情况，制定出合理的给药方案；

所述步骤四中临床症状评分包括对试验仔猪的精神状态、腹泻状态和食欲状态进行评分；

所述步骤四中使用“WindoW”法分析计算MaxDiff和CAR，得出临床临界值的选择窗，再使用CART回归树分析出临床临界值的范围的具体过程为：先采用“WindoW”带入POC和MIC计算参数MacDiff和CAR，得到MacDiff和CAR所形成的临床临界值的选择范围，再根据EUCAST提出的公式POC＝1/(1+e^-a+bf(MIC))，利用SPSS软件中的非线性回归对所得数据进行拟合，以MIC为自变量，POC为因变量，得到相应的模型表达式，然后计算治愈率为90％所对应的MIC值，最后用CAST回归树分析所得的数据，对MIC进行分段，得到不同MIC区间的治愈率。