[发明专利]一种鉴别发酵生产辅酶A过程中的菌种种属的试剂盒、方法和引物对

说明书

本发明公开了一种鉴别发酵生产辅酶A过程中的菌种种属的试剂盒、方法和引物对。所述的试剂盒包括PCR反应体系，所述PCR反应体系至少包括一种引物对，所述的引物对针对停滞棒杆菌的16srDNA设计；所述引物对的正向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。利用本发明的试剂盒通过PCR扩增反应及电泳检测、分析等一系列步骤准确地鉴别直接发酵生产辅酶A中菌种的种属来源，特别能够直接区分出是否为停滞棒杆菌，检测发酵中间体的菌种鉴定PCR方法，具有操作简便、成本低、准确性高以及重复性好等优点，极其便于推广应用。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种鉴别发酵生产辅酶A过程中 的菌种种属的试剂盒、方法和引物对。

背景技术

辅酶A系由泛酸、腺嘌呤、核糖、半胱氨酸及磷酸组成。它是体内乙酰 化反应的辅酶，对糖、脂肪及蛋白质的代谢起着非常重要的影响，因此是一 重要的生物化学药物，其临床应用范围较广，主要用于白细胞减少症，血小 板减少性紫癜，慢性肾机能不全所引起的急性无尿、肾病综合症、尿毒症、 初生儿缺氧、糖尿病酸中毒等。近年来，国内外主要的生产辅酶A的方法为 产氨短杆菌直接发酵法。2015版药典中在“生物制品生产鉴定用菌毒种管理 规程”表示生产和检定用菌毒种，包括DNA重组工程菌菌种，来源途径应 合法，并经药品监督管理部门批准。生物制品生产用菌毒种应采用种子批系 统，原始种子应验明其历史、来源和生物学特性。从原始种子传代和扩增后 保存的为主种子批。从主种子批传代和扩增后保存的为工作种子批，工作种 子批用于生产疫苗。工作种子批的生物学特性应与原始种子一致，每批主种 子批和工作种子批均应按各论要求保管、检定和使用。菌毒种的传代及检定 实验室应符合国家生物安全的相关规定，应建立生产用菌毒种主种子批全基 因序列的背景资料，减毒活疫苗主种子批应进行全基因序列测定。

微生物的菌种鉴定常规的鉴定内容有形态特征和理化特性。形态特征包 括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代 谢反应、酶反应和血清学反应等。还有自动鉴定系统，是以微生物对不同碳 源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对 应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。

目前应用最广泛的还是基于分子生物学的基因鉴定。然而现有技术中并 没有关于鉴定发酵生产辅酶A过程中的菌种种属的引物对以及试剂盒等的 记载。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏在发酵生产辅 酶A过程中对停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)进行有效检测的PCR 方法的缺陷，提供一种鉴别发酵生产辅酶A过程中的菌种种属的试剂盒、方 法和引物对。利用本发明的试剂盒通过PCR扩增反应及电泳检测、分析等 一系列步骤准确地鉴别直接发酵生产辅酶A中菌种的种属来源，能够直接区 分出是否为停滞棒杆菌，检测发酵中间体的菌种鉴定PCR方法，具有操作 简便、成本低、准确性高以及重复性好等优点，极其便于推广应用。

本发明建立了一个菌落快速PCR的体系，生产中发酵摇瓶菌种可无需 微生物基因组的提取，直接挑取部分菌体处理后，直接加入PCR反应体系 中，迅速快捷，实验结果与提取基因组后再PCR的结果相比，完全可用。经 本发明人诸多试验和研究，在产辅酶A的停滞棒杆菌16srDNA序列中挑选 出的特异性DNA分子量小，结构简单稳定。进一步地，又针对该基因序列 设计并筛选出了特定引物对。尝试不同常规PCR和菌落PCR的体系，找到 特异性强，灵敏度高的体系，进行普通PCR达到最佳效果。

本发明提供一种鉴别发酵生产辅酶A过程中的菌种种属的试剂盒，其包 括PCR反应体系，所述PCR反应体系至少包括一种引物对；

所述引物对的正向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示， 反向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；