[发明专利]酿脓链球菌的CRISPR核酸酶SpCas9的截短型高特异性变异体及其应用

权利要求书

1.一种CRISPR-Cas9核酸酶，属于CRISPR-Cas9系统，具有野生型CRISPR-Cas9核酸酶基因编辑功能，所述CRISPR-Cas9核酸酶是将野生型CRISPR-Cas9核酸的氨基酸序列 截掉8个即第494-501位的氨基酸后重组所得: 所述野生型CRISPR-Cas9核酸酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas9核酸酶，其特征在于，在同等反应条件下，所述CRISPR-Cas9核酸酶与野生型CRISPR-Cas9核酸酶相比，基因编辑特异性提高。

3.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas9核酸酶，其特征在于，所述野生型CRISPR-Cas9核酸酶为来源于酿脓链球菌的免疫系统SpCas9蛋白。

4.一种多核苷酸，其能够编码如权利要求1-3中任意一项所述的CRISPR-Cas9核酸酶。

5.一种表达载体，其包含如权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其包含权利要求5所述的表达载体。

7.一种制备权利要求1-3任意一项所述的CRISPR-Cas9核酸酶的方法，具体步骤包括：首先构建权利要求5所述的表达载体；然后，将所述表达载体转化至宿主细胞，筛选并挑出单克隆；最后，将所述单克隆诱导表达，并通过亲和层析、离子交换方法从表达产物中分离出所述的CRISPR-Cas9核酸酶。

8.权利要求1-3中任意一项所述CRISPR-Cas9核酸酶、权利要求4中所述的多核苷酸、权利要求5中所述的表达载体的用途，用于体外非治疗目的的基因组单位点或多位点基因编辑。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述编辑是单点编辑，或者是编辑位点大于等于两个的多点编辑；编辑方式为基因的删除、突变、插入、倒位、移位、重复或易位。

10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述CRISPR-Cas9核酸酶作为编辑工具包括与靶标DNA片段匹配的引导sgRNA。

11.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，是将权利要求5所述表达载体和与之匹配的引导sgRNA一同转入宿主细胞，对基因进行编辑。

12.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述单位点或多位点基因编辑，是利用权利要求1-3中任意一项所述CRISPR-Cas9核酸酶对双链DNA进行剪切，并通过宿主细胞的修复系统对断裂的缺口进行修复。

13.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述单位点或多位点基因编辑，是改变单位点或多位点编辑时的碱基突变特征。