[发明专利]酿脓链球菌的CRISPR核酸酶SpCas9的截短型高特异性变异体及其应用

说明书

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体为一种来源于酿脓链球菌的CRISPR核酸酶SpCas9的截短型高特异性变体及其应用。本发明Cas9核酸酶变体（THSpCas9），属于CRISPR‑Cas9系统，具有野生型CRISPR‑Cas9核酸酶基因编辑功能，CRISPR‑Cas9核酸酶是将野生型CRISPR‑Cas9核酸的氨基酸序截掉8个即第494‑501位的氨基酸后重组所得到;野生型CRISPR‑Cas9核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者，所述CRISPR‑Cas9核酸酶含有如SEQ ID NO.1所示90%的氨基酸序列，即SEQ ID NO.2。采用所述Cas9核酸酶变体（THSpCas9）能够提高编辑特异性，实现对基因组DNA片段的特定位置的精准编辑。

技术领域

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR-Cas9核酸酶SpCas9的截短型高特异性蛋白变体THSpCas9及其用途。

背景技术

由细菌免疫系统经漫长进化而产生的CRISPR-Cas9系统是一种革命性的基因编辑技术，被称为“基因魔剪”，可方便地对基因组特定基因的DNA链进行高效切割编辑，该系统的出现，大大克服了传统编辑技术耗时长的缺点，仅需数周就可以实现过去利用传统技术耗时一年之久才能完成的编辑^[1-11]。其中，来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR-Cas9核酸酶SpCas9是目前最为广泛使用的CRISPR核酸酶^[12]，被广泛应用到多个领域，包括医学研究以及生物技术等，比如细胞或动物模型的构建快速、功能基因的筛选便捷以及遗传疾病的治疗彻底^[13-24]。

虽然，CRISPR-Cas9系统的优势促使其能够广泛应用于许多领域，并最近在医学领域的研究上也异军突起，但仍有许多问题制约着其发展，尤其是得到一个精准靶向特异性疾病基因位点的CRISPR-Cas9核酸酶，至今是临床应用的瓶颈问题。然而，由于靶基因组极其复杂，sgRNA会与其他类似靶序列的基因位点发生局部匹配，进一步激活Cas9切割DNA，产生脱靶现象，从而影响DNA片段的正确遗传编辑，进而限制了该技术在精准医疗方面的应用^[25]。

因而，基于上述问题，探寻高特异性Cas9核酸酶从而有效地实现DNA片段的精准遗传编辑是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于酿脓链球菌的CRISPR-Cas9核酸酶SpCas9的截短型高特异性变体及其用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

本发明提供一种截短型高特异性CRISPR-Cas9核酸酶(THSpCas9)，所述CRISPR-Cas9核酸酶是将野生型CRISPR-Cas9核酸的氨基酸序截掉8(第494-501位)个氨基酸后重组所得，具有野生型CRISPR-Cas9核酸酶基因编辑功能，与野生型核酸酶相比，更能特异性靶向基因编辑位点，实现精准编辑。

所述野生型SpCas9核酸酶的核苷酸序列和氨基酸序列分别为SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2所示。

所述CRISPR-Cas9核酸酶(THSpCas9)的核苷酸序列和氨基酸序列分别为SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4所示，与野生型SpCas9的相似度达90％以上。

本发明还提供一种多核苷酸序列，可以转录和翻译所述的CRISPR-Cas9核酸酶(THSpCas9)。

本发明还提供一种表达载体，其含有上述多核苷酸序列。

本发明还提供一种宿主细胞，可以用于转化上述表达载体。