[发明专利]一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂及其应用

权利要求书

1.一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，采用能引起蛙类歪头病的病原菌作为多种混合活宿主菌培养噬菌蛭弧菌，然后过滤除去未被裂解的宿主病原菌得到噬菌蛭弧菌种子液，再以多种混合灭活宿主菌共培养，获得的蛭弧菌培养液先加冻干保护剂混合均匀后，再加冻干载体混合得到待冻干制剂，最后通过冷冻干燥制备获得。

2.根据权利要求1所述的一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述多种混合活宿主菌和多种混合灭活宿主菌为：脑膜炎脓毒性黄杆菌、米尔伊丽莎白菌、铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌的3种或者3种以上。

3.根据权利要求1所述的一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述噬菌蛭弧菌制剂最终得到的粉末状外观为疏松块状结构，水份5-8wt％，活菌数可达1.0*10¹⁰PFU/g以上。

4.根据权利要求1所述的一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述多种混合灭活宿主菌采用水浴温度60-80℃，保温10-30min，制备获得。

5.根据权利要求1所述的一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述冷冻干燥时，冻干保护剂为甘油1-2％(v/v)，冻干载体为蔗糖2-10wt％、脱脂奶粉90-98wt％的组合物，且蛭弧菌培养液与冻干载体按质量比1:0.5-1的比例混合。

6.根据权利要求1所述的一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，所述的噬菌蛭弧菌制剂，冻干处理参数为预冻温度-50℃至-30℃，预冻时间为2-5h，冷冻干燥过程温度范围-40℃至10℃，冻干时间为24-48h。

7.根据权利要求1所述的一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，制备的方法包括以下步骤：

(1)多种混合活宿主菌制备：挑取3株或3株以上活化宿主菌，接种于10g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏，5g/L氯化钠，pH7.0-7.5的培养基中，好氧培养20-24h后，离心收集菌泥，并用灭菌生理盐水震荡清洗再离心，重复3次，收集最终菌泥混合，备用；

(2)噬菌蛭弧菌种子液制备：取上述步骤(1)菌泥直接用灭菌生理盐水稀释，使菌浓度在10⁸-10¹⁰CFU/mL接种蛭弧菌，于25-33℃，好氧培养18-72h，所得培养液于4000r/min，温度4-8℃，离心15-20min，后用无菌的5μm醋酸纤维素膜过滤，备用；

(3)多种混合灭活宿主菌制备：将步骤(1)所得菌泥直接用少量灭菌生理盐水稀释，使菌浓度在10⁸-10¹⁰CFU/mL，于60-80℃，水浴10-30min，迅速冷却，备用；

(4)噬菌蛭弧菌菌液制备：将取上述步骤(3)所得多种混合灭活宿主菌，按2-5％(v/v)加入步骤(2)所得的种子液，于25-33℃，好氧培养18-72h，获得蛭弧菌，活菌数在1-5*10¹⁰PFU/mL；

(5)噬菌蛭弧菌冻干粉制备：将步骤(3)灭活宿主菌液按1-50％(v/v)加入步骤(4)，好氧培养1-3h后，按加入1-2％(v/v)甘油，搅拌均匀，再按1:0.5-1比例加入冻干载体，搅拌均匀后开始分装进行预冻处理，预冻结束进行反复抽真空，使得最终为粉末状。

8.根据权利要求7所述的一种预防蛙类歪头病的噬菌蛭弧菌制剂，其特征在于，优选地，步骤(1)-步骤(5)中所述好氧培养的条件包括温度为25-33℃，通空气量各自独立地为0.5-1.5m³/h，培养时间为18-72h；步骤(2)与步骤(5)中所述好氧培养均在搅拌下进行，且搅拌的转速各自独立地为50-100r/min；

优选地，步骤(1)中所述多种混合活宿主菌为脑膜炎脓毒性黄杆菌、米尔伊丽莎白菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌其中的3种或者3种以上。