[发明专利]一种自组装预血管化干细胞膜片的制备方法

权利要求书

1.一种自组装预血管化干细胞膜片的制备方法，其特征在于：选择人间充质干细胞作为种子细胞初步构建MSC膜片；将人内皮细胞直接接种到MSC膜片表面，建立EC-MSC膜片共培养模型；使用共培养条件培养基连续培养10-14天完成预血管化EC-MSC复合膜片的构建；

具体步骤包括：

S1.MSC膜片的制备：取原代培养的人间充质干细胞扩增至第4代至第5代，调整细胞密度为2.6-3.6×10⁴个/平方厘米接种在培养板中，第二天更换膜片诱导培养液，隔日换液，在37℃、饱和湿度、5％CO₂条件下连续培养6天，初步构建MSC膜片；

S2.EC-MSC膜片共培养模型的建立：取原代培养的人内皮细胞扩增至第4代至第5代，调整细胞密度为2.6-4.7×10⁴个/平方厘米接种到初步构建的MSC膜片表面，使内皮细胞和间充质干细胞膜片直接接触并整合，建立EC-MSC膜片共培养模型；

S3.预血管化EC-MSC复合膜片的制备：更换共培养EC-MSC膜片的培养液为共培养条件培养基，在37℃、饱和湿度、5％CO₂条件下连续共培养10-14天，隔日换液，当在培养皿底部出现乳白色膜样物质，即完成预血管化EC-MSC复合膜片的构建；

步骤S3所述共培养条件培养基包含体积百分比为66.7％-33.3％的无因子的内皮基础培养液，和体积百分比为33.3％-66.7％的低血清膜片诱导培养液；

所述低血清膜片诱导培养液包含5％胎牛血清(v/v)、0.2-0.4mg/mL谷氨酰胺、50-100μg/ml维生素C，余量为α-MEM培养液；

所述无因子的内皮基础培养液包含5％胎牛血清(v/v)，余量为EBM培养液。

2.根据权利要求1所述一种自组装预血管化干细胞膜片的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述原代培养的人间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述一种自组装预血管化干细胞膜片的制备方法，其特征在于，步骤S2所述使用的人内皮细胞为原代培养的人脐动、静脉内皮细胞，或者肺动、静脉内皮细胞。

4.根据权利要求1所述一种自组装预血管化干细胞膜片的制备方法，其特征在于，步骤S1所述膜片诱导培养液包含10％胎牛血清(v/v)、0.2-0.4mg/mL谷氨酰胺、50-100μg/ml维生素C，余量为α-MEM培养液。

5.根据权利要求1所述一种自组装预血管化干细胞膜片的制备方法，其特征在于，所述共培养条件培养基包含体积百分比为66.7％的无因子的内皮基础培养液，和体积百分比为33.3％的低血清膜片诱导培养液。

6.根据权利要求1所述一种自组装预血管化干细胞膜片的制备方法，其特征在于，所述共培养条件培养基包含体积百分比为33.3％的无因子的内皮基础培养液，和体积百分比为66.7％的低血清膜片诱导培养液。

7.根据权利要求1所述一种自组装预血管化干细胞膜片的制备方法，其特征在于，所述共培养条件培养基包含体积百分比为50％的无因子的内皮基础培养液，和体积百分比为50％的低血清膜片诱导培养液。