[发明专利]一种自组装预血管化干细胞膜片的制备方法

说明书

本发明公开了一种利用间充质干细胞的旁分泌作用在体外自组装形成预血管化干细胞膜片的制备方法，系使用人间充质干细胞(hMSC)在体外成膜片诱导6天，初步形成MSC膜片，之后将内皮细胞(EC)以饱和密度直接接种在其表面，并更换培养液为共培养条件培养基继续培养十天，完成预血管化EC‑MSC复合膜片的构建。与传统的添加生长因子促进膜片血管化的方法相比，本发明之血管化膜片形成的血管网更符合生理形态、血管成熟度高，制备成本低，且在植入体内后可快速与宿主血管形成吻合，无渗漏。该技术可在短时间内重建缺损组织的血管系统，有助于大面积组织缺损的修复与再生，为血管化组织工程提供了新的思路，具有广阔的应用价值。

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，尤其涉及一种自组装预血管化干细胞膜片的制备方法。

背景技术

细胞膜片技术是在体外连续培养高密度接种的细胞，使其复层生长，形成一张富含细胞和细胞外基质的膜状结构，并采用非酶解的方式对其进行收获，具有独特的保存细胞-细胞外基质与细胞间信号分子、细胞利用率高、可塑性好等优点。该技术已经成为现代再生医学的一个重要组成部分，并显示出巨大的临床应用前景。当使用多层细胞膜片对组织进行修复时，弥散作用仅能保证表层的细胞存活，而位于内部深层的细胞往往因营养缺乏而发生坏死，从而不能形成良好的组织再生效果。因此，构建含有微血管网络结构的细胞膜片是实现血管化组织工程以达到良好组织再生的关键。

目前，日本学者Sasagawa和Asakawa等设计了单层细胞叠加装置，分别将内皮细胞与成肌细胞或成纤维细胞层层叠加，并通过含因子的内皮培养液诱导形成预血管化的多层成肌细膜片或成胞纤维细胞膜片。国内学者张等将人血管内皮细胞接种于低氧诱导的人间充质干细胞膜片上，用含因子的内皮培养基EGM2诱导形成预血管化的干细胞膜片。以上研究均依赖在培养液里添加外源性促血管生长因子来实现预血管化膜片的构建。干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，不仅如此它还具有自分泌和旁分泌多种细胞因子和免疫调节的作用。研究发现，干细胞能表达、合成、分泌生长因子、细胞因子、调节肽等多种生物活性因子，发挥抗凋亡、抗炎和促进血管生成等效应，进而促进缺血后心脏、肾脏和中枢神经器官功能的恢复。已经有大量研究表明MSC能通过旁分泌机制有效修复缺血损伤的血管：MSC可分泌趋化因子，如单核细胞化学趋化蛋白-1(MCP-1)、干细胞衍生因子-1(SDF-1)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF-α)及白细胞介素8(IL-8)等细胞因子促进造血过程。在缺氧条件下，MSCs能上调一系列促血管生长因子及抗凋亡生长因子的表达，其中包括血管生成素-1/2(Ang-1/2)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PLGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、血小板源生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF-1)和肝细胞生长因子(HGF)等。以上研究提示：干细胞潜在的旁分泌/自分泌功能可能参与调节正常血管的发生过程，包括内皮细胞增殖、分化、迁移、管腔形成等多个环节，进而调节血管生成与重塑。

发明内容

本发明将人间充质干细胞(hMSC)作为种子细胞构建MSC膜片，将血管内皮细胞(EC)与之共培养，利用MSC分泌的多种生物活性因子促进EC的分化、迁移、管腔形成，从而在体外无外源性生长因子的情况下自组装形成含有微血管网络结构的EC-MSC复合膜片。

一种自组装预血管化干细胞膜片的制备方法，按照如下步骤制成：

步骤1.MSC膜片的制备：取原代培养的人间充质干细胞扩增至第4代至第5代，调整细胞密度为2.6-3.6×10⁴个/平方厘米接种在培养板中，第二天更换膜片诱导培养液，隔日换液，在37℃、饱和湿度、5％CO₂条件下连续培养6天，初步构建MSC膜片；