[发明专利]一种微载体细胞三维复合体冷冻保存液及应用

说明书

本发明提供一种微载体细胞三维复合体的冷冻保存液和冷冻保存方法及其应用，所述的冷冻保存液包含：基础培养基、胎牛血清、二甲基亚砜以及抗冻糖蛋白。本发明还提供了一种冷冻保存微载体细胞三维复合体的方法，其特征在于将微载体细胞三维复合体与冷冻保存液混合后，在4℃摇床上平衡20 min，使冷冻保存液与微载体上的细胞充分接触，然后再缓慢降温至‑80℃，‑80℃过夜后可以液氮中长期保存。本发明在冷冻保存液中添加抗冻糖蛋白加强了对细胞的保护，且无毒副作用。采用本发明的冷冻保存液和冷冻保存方法显著提高了微载体细胞的复苏率，使微载体培养细胞的冻存成为可能，缩短了微载体培养细胞的培养周期，降低成本，对微载体细胞的研究和广泛应用提供了帮助。

技术领域

本发明涉及细胞冻存领域，具体地涉及一种微载体细胞三维复合体的冷冻保存液及所述冷冻保存液的使用方法及其应用。

背景技术

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。将细胞冷冻在液氮（-196℃）中，细胞酶的代谢受到抑制，使细胞暂时脱离生长状态而将细胞特性保存起来，在需要的时候复苏细胞用于实验，而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到细胞保种的作用。

体外培养的细胞生长方式有悬浮生长和贴壁生长，在常规的细胞冻存时，贴壁细胞需要经酶消化使之脱离生长表面成为单细胞悬液，然后离心收集细胞后冻存。贴壁细胞的生长除使用培养瓶和培养皿等平面培养方式外，为获得大量细胞或为提供三维生长环境，常使用微载体培养技术。微载体多是球形颗粒，可提供较平面培养大得多的生长面积，还可以提供三维培养的立体环境。传统的保存微载体上高密度培养的细胞方法是从微载体上收获细胞，再将收获的细胞悬液进行冻存，不仅操作复杂，而且在一定程度上会损失细胞量，另外将细胞从微载体上分离后会破坏细胞与微载体的黏附关系，造成细胞存活率下降。此外，使用大孔微载体时，细胞生长在孔隙中很难消化回收。后续需要继续微载体培养时，需要将冻存的细胞复苏后先进行平面培养，待细胞状态恢复后重新接种到新的微载体上，因此，如果可以直接冻存微载体细胞三维复合体将对微载体培养技术应用提供更大优势。

目前，单细胞悬液的冻存技术非常成熟。在细胞冻存过程中，为避免暴露于低温环境可能引起的细胞损伤，通过在冷冻保存液中加入冷冻保护剂来保护细胞。冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂：可渗透到细胞内，一般是小分子物质，主要包括二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、乙二醇、甘油、丙二醇、甲酰胺等，在溶液中易结合水分子发生水合作用，使溶液的粘性增加，弱化了水的结晶过程，达到保护目的。非渗透性冷冻保护剂：能溶于水但不能渗透到细胞内，一般是大分子物质，主要包括：海藻糖、蔗糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等，它使溶液呈过冷状态，在特定温度下降低溶质的浓度，通过改变渗透压引起细胞脱水，从而起到细胞保护作用。

上述渗透性和非渗透性冷冻保护剂均为化学物质，目前细胞冻存多采用DMSO作为冷冻保护剂，DMSO能与细胞内水分子进行结合，减缓水的结晶，防止细胞低温冻存损伤，但在室温下有较强的细胞毒副作用。

联合使用多种冷冻保护剂是提高冻存质量的一种方法，但过多的冷冻保护剂意味着过多残留，增加了复苏后细胞存活的风险。抗冻蛋白是一类具有提高生物抗冻能力的蛋白质类化合物的总称。现已发现五种，包括抗冻糖蛋白、抗冻蛋白Ⅰ、抗冻蛋白Ⅱ、抗冻蛋白Ⅲ和抗冻蛋白Ⅳ。最初是从南极与北极地区的海洋鱼类血清中发现一种能与冰晶相结合的特异性蛋白质，它能阻止体液内冰核的形成与生长，维持体液的非冰冻状态。在这些地区生活的鱼类全都具有合成这类蛋白的能力，以适应低温的生活条件。