[发明专利]一种高纯人凝血因子IX制剂的生产方法

说明书

本发明公开了一种工艺步骤少、生产成本低、高比活性的高纯人凝血因子IX制剂生产方法。包括以下步骤：(1)血浆冷沉淀去除；(2)DEAE sephadex A50阴离子交换层析；(3)S/D灭活病毒；(4)非Casupgt;2+/supgt;依赖型IX因子免疫亲和层析；(5)配液加保护剂；(6)纳滤膜除病毒过滤；(7)分装，冷冻干燥。本发明通过采用高吸附特异性的新型免疫亲和层析极大简化了人凝血因子IX生产工艺，所制得的高纯人凝血因子IX成品效价可达114.2IU/ml，IX因子比活性高达196.5IU/mg蛋白以上；此外，本发明采用了具有高度成熟性与安全性的S/D法+纳滤法进行两步病毒灭活，有效保证了制品的安全性。

技术领域

本发明属于生物制药和血液制品技术领域，具体涉及血液制品生产中一种工艺步骤少、生产成本低、高比活性的高纯人凝血因子IX制剂生产方法。

背景技术

人凝血因子IX(human coagulation factor IX,h FIX)是一种具有关键作用的凝血因子，属于维生素K依赖性糖蛋白，是人体内源性凝血级联反应中丝氨酸蛋白酶的前体，在人体内源性凝血途径中发挥着非常重要的作用。

乙型血友病是一种罕见的遗传疾病，发病率约为1/25000。乙型血友病的病因在于凝血因子IX的缺失，患者一旦出血后，就需要极长的时间来凝血。一些轻微的受伤，就可能带来足以威胁生命的影响。对于病情严重的患者，他们的关节和肌肉还会经常自发出血，带来痛苦。目前针对这一疾病的主流疗法是使用人凝血酶原复合物(Prothrombin ComplexConcentrate,PCC)输注治疗，控制和预防出血事件。

但使用PCC治疗乙型血友病或凝血因子IX缺乏症时，由于PCC中含有维生素K依赖性凝血因子ⅡI、VⅡ、IX、X以及蛋白C、蛋白S、a-胰蛋白酶抑制剂、高分子量激肽原等，因而大剂量使用PCC可能会引起血栓形成和弥漫性血管内凝血，具有一定的风险。因此，从血浆中分离出高纯度凝血因子IX制品可有效控制患者的出血状况，并且显著降低患者用药过程中血栓发生的风险，具有相当大的市场前景，国内外对高纯凝血因子IX制品的研究热情极高。随着临床医生的逐步认可，高纯凝血因子IX产品的使用量也在逐年增加；目前，我国尚未有血浆来源的高纯凝血因子IX产品上市，加之原料血浆紧张，血浆来源的高纯凝血因子IX产品市场短缺，其生产制备引起了各方面的关注。

蔡骏等在《柱层析法制备高纯人血FIX研究初探》中报告了一种用DEAE SephadexA50,DEAE-Sepharose FF和Heparin-Sepharose CL-6B制备高纯度凝血因子IX的方法，最终凝血因子IX成品比活为35±2.0IU/mg,回收率约为30％。赵彦鼎等人在《自制填充介质对人血浆凝血因子IX的层析分离》中采用自制的DEAE Bio-Sep FF和肝素Bio-Sep介质，经过2步弱阴离子交换和1步亲和层析从去冷沉淀血浆中分离纯化凝血因子IX,成品比活达到99.40IU/mg,回收率约为30％。上述方法均使用2步阴离子交换和1步肝素亲和层析纯化凝血因子IX,产品得率尚可，但由于肝素配基填料开发初衷是作为AT-Ⅲ的吸附剂，该凝胶对于AT-Ⅲ、凝血因子(包括VⅡ,IX)、脂蛋白、脂酶、蛋白合成因子；激素、类固醇受体、核酸结合酶、限制性内切酶、干扰素等数十种蛋白种类均有吸附作用，对于人凝血因子IX的吸附特异性不强，故以上制备工艺所制备的人凝血因子IX成品比活性均较低，甚至不能满足欧洲药典中要求比活性不低于50IU/mg的最低要求，因此，以上制备工艺均不具备批量生产价值。

公开日为2008.10.22,公开号为CN101291951A的专利申请《一种高纯度的人第IX凝血因子的制备方法》公开了一种利用2次阴离子交换层析、肝素亲合层析、阳离子交换层析从血浆来源纯化人第IX凝血因子的制备方法，该方法通过增加层析工艺步骤的方式提高比活性，所制备的人IX凝血因子比活性较高，可达150IU/mg。但由于其生产工艺繁琐，需经过4次层析步骤，本领域专业技术人员公知，每经过1次层析纯化步骤，均不可避免地会造成目标蛋白损失，因此，该制备工艺产品得率较低；此外，4次层析步骤需耗费大量凝胶填料，生产成本极高，不便于大范围推广。