[发明专利]CRISPR/Cas9系统介导的山羊KRTAP13-1基因敲除的方法

说明书

本发明利用CRISPR/Cas9系统介导完成山羊KRTAP13‑1基因定点敲除，本研究依据山羊的KRTAP13‑1基因序列，构建基于CRISPER/Cas9系统的Cas9/gRNA打靶载体；然后将优化后的Cas9/gRNA共表达敲除载体转染至山羊胎儿成纤维细胞中，获得KRTAP13‑1基因定点敲除的细胞株。本发明所构建的基于CRISPER/Cas9系统的敲除载体为山羊KRTAP13‑1基因定点敲除提供了一种简单快捷安全的途径。该方法在细胞株筛选过程中没有涉及任何筛选标记基因，从而大大提高了转基因动物的安全性，对山羊的基因功能以及遗传育种的研究具有重要价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学及动物遗传育种领域，具体地说，涉及 CRISPR/Cas9技术介导的山羊KRTAP13-1基因定点敲除的方法。

背景技术

在目前的生命科学领域内，CRISPR/Cas系统作为第三代基因编辑工具展现出巨大的潜力和前所未有的影响力。在动物学、植物学和医学等领域都引起了巨大的变革，也得到了充分的肯定。在CRISPR/Cas 系统出现之前，对于基因的定点修饰作用主要通过锌指核酸酶(ZFN) 和转录激活因子效应物(TALE)实现。但这两项技术仅限于某些模式生物并且效率较低，还需要对每个靶位点进行复杂的蛋白质工程，这也大大增加了实验难度和成本。CRISPR/Cas9系统不同于第一代的ZFN 和第二代的TALE技术，它是一种使用互补RNA引导序列实现对目标位点精准识别的基因编辑过程，而且Cas9蛋白是一类不需要与其他蛋白质融合表达的核酸酶，只需要合成与靶序列互补的引导RNA分子就可以编辑几乎所有的基因位点。正是由于这种特性，大大简化了实验设计难度，使得基因编辑技术得到了前所未有的广泛应用。

内蒙古白绒山羊是我国特有的优秀山羊品种，有着饲养简单、育成时间短、绒肉兼用等特点，主要分布于内蒙古西部地区，是目前世界上产绒量最高、绒纤维品质最好的山羊品种。其产绒量约占中国的一半以上，占世界羊绒产量的1/3。而山羊绒作为绒山羊最重要的经济组成部分，是由山羊次级毛囊生长的珍贵绒毛纤维，又因为产量稀少导致价格十分昂贵。其中衡量羊绒品质和经济价值的核心指标就是羊绒细度。但目前在羊绒产业中对羊绒细度性状的维持和保护却远远不够。故培育超细绒型的绒山羊新品系显得十分重要。相对于传统育种，现代生物技术极大程度地缩短了育种所需时间，农业生物新品种培育提供了新的技术途径。

角蛋白是生物体内一种重要的结构蛋白，是毛发等皮肤衍生物的主要组成成分，对毛囊发育与毛发结构起到重要的作用。角蛋白家族又由角蛋白关联蛋白(KAP)和角蛋白中间丝蛋白(KIF)组成。其中 KIF基因的编码序列和结构基础在进化过程中相对保守，物种间差异并不显著。而KRTAP基因则在不同物种和相同物种不同种系间都存在显著差异，是决定毛发结构和性状的主效基因家族。目前，依据氨基酸一致性和相关含量将KRTAP家族划分为三大类：高硫KRTAP家族、超高硫KRTAP家族和高甘氨酸/酪氨酸KRTAP家族。其中高硫KRTAP 家族中的KRTAP13-1基因，在山羊、绵羊与人类的序列分析中存在高度同源性。并且在前期研究中发现，在人类毛囊中，KAP11-1和KAP13-1 是分布范围最广泛的两种KAP。同样对绵羊毛囊蛋白质组学研究表明， KAP11-1和KAP13-1是在毛囊形态发生过程中最早表达的两种KAP。这两种KAP可能参与了毛囊的构成并进而影响了毛发性状。虽然， KRTAP13-1基因已经被证实与绒毛纤维直径性状存在密切联系。在中国的一些绵羊和山羊品系中：新吉细毛羊、西藏绒山羊、博格达绒山羊、内蒙古绒山羊和辽宁绒山羊中均发现KRTAP13-1基因的多态性变化对于羊绒纤维性状存在着较大的影响。但是现在并未有研究揭示 KRTAP13-1基因对于毛囊结构和发育的具体作用机制，故而探究 KRTAP13-1基因对毛囊的研究工作有着重要意义。

利用CRISPER-Cas9系统敲除山羊KRTAP13-1基因的研究未见报道

发明内容

发明的目的是提供CRISPR/Cas9系统介导山羊KRTAP13-1基因定点敲除的方法。