[发明专利]一种利用微液滴催化芦丁产异槲皮苷的酶催化反应体系

说明书

一种利用微液滴催化芦丁产异槲皮苷的酶催化反应体系。应用流动聚焦型芯片，以重组菌株E.coli BL21(DE3)‑pET21a‑rhaB1发酵获得的粗酶液和含底物的缓冲液按相比1:1(v/v)混合为分散相，硅油为连续相，调控分散相和连续相的压力范围为25～200mbar，制备微液滴。配制芦丁溶液和α‑L‑鼠李糖苷酶的粗酶液，应用微液滴酶制备活性产物异槲皮苷。将含微液滴酶反应体系的导管置于25～60℃，0.1～5h后取出，收集导管内备用。本发明采用微流控芯片可制备特定的液滴，将其作为独立的微反应器，具有体积小、比表面积大、环境封闭且稳定、药品用量少、无交叉污染等优势，并能提高酶促合成效率。

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种利用微液滴催化芦丁产异槲皮苷的酶催化反应体系。

背景技术

微液滴是指两种互不相融的液体所形成直径在微米或纳米级的液滴。它利用流体剪切力和表面张力之间的相互作用将连续的液体分离成微型液滴(微纳电子技术,2016,53:108-113.)。微液滴技术具有许多优点，微液滴可作为一个小体积的反应体系，将反应物料包封在微滴内，可显著加快混合的速率和物质之间的反应；反应时间可控，液滴尺寸也可精确控制，同时微液滴芯片可重复使用(Chemical Engineering Science,2016,169:273-283)。此外，液滴反应器提供的匀质效应可大大提高反应效率，如微液滴可将常规反应器中仅60％的水解反应效率提高至100％(ChemPlusChem,2016,81:629-636)，显示了微液滴系统应用于酶催化反应的巨大优势。

芦丁(Rutin)，能够为α-L-鼠李糖苷酶催化转化为异槲皮苷和L-鼠李糖(现代食品科技,2015(1):107-114.)。异槲皮苷属黄酮类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗抑郁、降压、降脂等众多药理作用(海峡药学,2015:223-225)，临床上用于治疗心肌缺血、缺氧等，国际上将其加工成食品添加剂和辅助药物，可作为药物有效成分而直接用于药物生产，比前体物芦丁(含量5～20％)具有更强的抗氧化性和抗癌活性(Biotech,2016,6:3)，更是合成新型食品着色剂EMIQ(Enzymatically Modified Isoquercitrin)的中间体(NeurochemistryInternational,2010,57:713-721)，作用效果显著，应用面广。

自然界中的鼠李糖苷酶有α-L-鼠李糖苷酶和β-L-鼠李糖苷酶两类(中国酿造,2010,29:11-15)。截至目前，由于条件限制，α-L-鼠李糖苷酶尚未进行规模化生产，导致纯酶价格偏高，酶的应用发展受到制约。HFM-rha78是从健康人体粪便宏基因组DNA中获得的新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因，在37℃下随酶浓度增加芦丁转化率增大，作用10h时芦丁转化率为41.8％(中国生物化学与分子生物学报,2018,34(12))。

重组菌株表达的α-L-鼠李糖苷酶比野生菌株更有利于芦丁催化为异槲皮苷的定向反应(江苏科技大学,2017)。酶法催化合成异槲皮苷存在一大问题，芦丁及其水解产物异槲皮苷和槲皮素均具有强抗氧化性，受热不稳定，长时间会导致氧化或其他反应物生成。因此，一个封闭体系用于α-L-鼠李糖苷酶催化芦丁生成异槲皮苷，有望解决产物、底物不稳定、容易被氧化等技术瓶颈。

发明内容

本发明针对水解芦丁的生物催化剂α-L-鼠李糖苷酶来源稀少且价格昂贵，造成了生产异槲皮苷的成本过高的问题，提供了一种利用微液滴催化芦丁产异槲皮苷的酶催化反应体系，该酶催化反应体系反应条件温和、底物选择性强、环境友好，可处理仅有少量液体的全新技术，提高胞内酶与底物接触几率。

一种利用微液滴催化芦丁产异槲皮苷的酶催化反应体系，所述酶催化反应体系通过以下步骤构建：

步骤1，构建重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET21a-rhaB1，培养并诱导表达，诱导表达结束后，离心使得细胞破碎，取上清液，即粗酶液备用；