[发明专利]一种荧光素衍生物及其合成方法和应用

权利要求书

1.一种荧光素衍生物Ac，名称为3-氧代-3'-(4-(5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰基)哌嗪-1-基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-黄嘌呤]-6'-基丙烯酸酯，结构式为：

。

2.如权利要求1所述的一种荧光素衍生物Ac的合成方法，其特征在于，步骤如下：

1）在冰水浴的条件下，将哌嗪荧光素2.00g溶解在10 mL N,N-二甲基甲酰胺中，随后，在氩气保护的条件下，在该体系中加入生物素和4-二甲氨基吡啶，然后将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解在 5mL 无水的N,N-二甲基甲酰胺中，用恒压滴液漏斗将其缓慢滴加到反应体系中，在室温下搅拌反应12 h；反应完成后，将反应体系倒入到冰水中，有黄色固体析出，抽滤得到黄色粉末状固体，经柱色谱分离得化合物A：4-（5-（4-（3'-羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-6'-基）哌嗪-1-基）-5-氧代戊基）四氢1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-2（3H）-酮；

2）在冰水浴的条件下，将步骤1）所得化合物A 0.47g溶解在25 mL二氯甲烷中，然后，在该体系中加入三乙胺0.30g，将反应体系搅拌10 min后，用恒压滴液漏斗将丙烯酰氯0.09g缓慢滴加到反应体系中，将反应体系在室温下搅拌约24 h；体系减压蒸干溶剂得到粗产品，经柱色谱分离，纯化得目标固体Ac。

3.如权利要求1所述的荧光素衍生物Ac在制备半胱氨酸检测试剂中的应用。

4.一种检测半胱氨酸的方法，包括如下步骤：

（1）、配制pH=7.4、浓度为10 mM的PBS缓冲溶液，配制20 mM的半胱氨酸水溶液，配置5mM的权利要求1所述荧光素衍生物Ac的乙腈溶液；

（2）、取2 mL的pH 7.4的PBS溶液加到一个荧光比色皿中，0.8 µL Ac的乙腈溶液加入到上述体系中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样半胱氨酸的加入, 550 nm处的荧光强度逐渐增强；

（3）、在11个比色皿中，各加入2 mL的pH 7.4的PBS溶液，分别加入半胱氨酸溶液的体积为0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40 µL，40 min后在荧光光谱仪上测定550 nm处荧光强度为42.37、1121、1872、2511、2985、3465、3796、4163、4445、4690、4830，以半胱氨酸浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制图，得到半胱氨酸浓度的工作曲线；线性回归方程为：F =14.62 c + 620.53，c的单位为10^-6 mol/L；

(4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得半胱氨酸的浓度。

5.如权利要求1所述的荧光素衍生物Ac在制备细胞成像试剂中的应用。

6.如权利要求1所述的荧光素衍生物Ac在制备细胞成像区别癌细胞和正常细胞试剂中的应用。