[发明专利]一种荧光素衍生物及其合成方法和应用

说明书

本发明公开了一种荧光素衍生物及其合成方法和应用，所述衍生物的中文名称为3‑氧代‑3'‑(4‑(5‑(2‑氧代六氢‑1H‑噻吩并[3,4‑d]咪唑‑4‑基)戊酰基)哌嗪‑1‑基)‑3H‑螺[异苯并呋喃‑1,9'‑黄嘌呤]‑6'‑基丙烯酸酯，命名为Ac。本发明提供了一种荧光素衍生物Ac对半胱氨酸检测的方法，在pH 7.4的PBS溶液中，通过荧光分光光度计定量检测半胱氨酸的含量。该检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。本发明的荧光素衍生物Ac可通过激光共聚焦荧光成像技术检测内源性和外源性的半胱氨酸，并且可以应用到区分正常细胞和癌细胞，在生物分子检测领域具有应用前景。

技术领域

本发明涉及荧光探针，特别涉及一种荧光素衍生物及其合成方法，以及该衍生物在检测半胱氨酸并实现区分正常细胞和癌细胞中的应用。

背景技术

癌症的治疗已经受到广泛关注，设计和合成能够区分正常细胞和癌细胞的荧光探针很有必要。经了解，生物素可以靶向癌细胞过表达的生物素受体，生物素(Biotin)为B族维生素之一，又称维生素H、维生素B7、辅酶R(Coenzyme R)等，它可以作为靶向癌细胞的基团以增强探针对癌细胞的特异性。而且，研究表明半胱氨酸的含量异常会引起很多疾病的产生，比如半胱氨酸缺乏与发育迟缓、脑损伤、水肿、肝脏受损、虚弱风湿性关节炎、帕金森病、阿尔茨海默病等有关。同时，半胱氨酸在人体中含量水平的升高，可能导致严重的神经毒性和心血管疾病。因此，开发有效的方法监测半胱氨酸并且实现区分不同细胞具有重要研究意义，对于生物研究和临床诊断起着至关重要的作用。

目前，大部分荧光探针可以实现半胱氨酸的检测，但既能检测半胱氨酸并且区分癌细胞和正常细胞的荧光探针少之又少。因此研究开发一种检测半胱氨酸并且实现区分癌细胞和正常细胞的探针显得尤为重要。

在本发明中，合成了一种基于荧光素的化合物，通过半胱氨酸和化合物在亲核取代反应前后荧光变化，实现半胱氨酸的检测，并且通过生物素和过表达的生物素受体结合，实现不同细胞的区分。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作方便，选择性好，溶解度好，灵敏度高的检测半胱氨酸并可实现区分癌细胞和正常细胞的荧光素衍生物及其合成方法和应用。

本发明提供的一种荧光素衍生物，中文名称为3-氧代-3'-(4-(5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰基)哌嗪-1-基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-黄嘌呤]-6'-基丙烯酸酯，英文名称为3-oxo-3'-(4-(5-(2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanoyl)piperazin-1-yl)-3H-spiro[isobenzofuran-1,9'-xanthen]-6'-ylacrylate命名为Ac。结构式为：

Ac的合成方法，步骤如下：

1)在冰水浴的条件下，将哌嗪荧光素2.00g溶解在10mL N,N-二甲基甲酰胺中，随后，在氩气保护的条件下，在该体系中加入生物素和4-二甲氨基吡啶，然后将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解在5mL无水的N,N-二甲基甲酰胺中，用恒压滴液漏斗将其缓慢滴加到反应体系中，在室温下搅拌反应12h；反应完成后，将反应体系倒入到冰水中，有黄色固体析出，抽滤得到黄色粉末状固体，经柱色谱分离得化合物A：4-(5-(4-(3'-羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-6'-基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊基)四氢1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-2(3H)-酮；

2)在冰水浴的条件下，将步骤1)所得化合物A 0.47g溶解在25mL二氯甲烷中，然后，在该体系中加入三乙胺0.30g，将反应体系搅拌10min，随后，用恒压滴液漏斗将丙烯酰氯0.09g缓慢滴加到反应体系中，将反应体系在室温下搅拌约24h；体系减压蒸干溶剂得到粗产品，经柱色谱分离，纯化得目标固体Ac。

所述的荧光素衍生物Ac可在半胱氨酸检测中应用。