[发明专利]无血清的脐带间充质干细胞培养基

说明书

本发明公开了一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，用于培养脐带间充质干细胞，由无血清基本培养基和添加成分组成；添加成分为重组人成纤维细胞生长因子hFGF、重组人表皮生长因子hEGF、胰岛素hI、L‑谷氨酰胺、2‑巯基乙醇、亚硒酸钠、转铁蛋白、人血清白蛋白、纤粘连蛋白、黄芪多糖APS、IL‑3、IL‑6、IL‑r、人参提取物、玫瑰提取物、茉莉花提取物、维生素C。

技术领域

本发明涉及干细胞的研究领域，特别是涉及一种新型、高效的适用于脐带间充质干细胞大规模培养的无血清培养基。

背景技术

脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多能干细胞，细胞表面强表达特异性标记CD90，CD73，CD105，不表达造血系或内皮系细胞的标记CD45、CD14、CD11、CD34、CD19，低表达或不表达主要组织相容性抗原HLA-DR。研究显示，脐带间充质干细胞具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化如骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝内皮和心肌等。与骨髓间充质干细胞相比，脐带间充质干细胞含量和增殖能力均优于后者，且免疫原性低、取材方便、无伦理学争议等优点，因此在间充质干细胞中具有更高的临床应用价值。

在实际临床应用中，无外源性污染和细胞数量是保证脐带间充质干细胞治疗的必要因素。目前，脐带间充质干细胞的培养体系大都含有动物血清(如胎牛血清)，一方面由于血清中不明蛋白的存在，对细胞的信号转导和细胞表面标志形成干扰，另一方面采用添加血清培养的干细胞进行体内移植，可能引起病原体的交叉感染，因此需要开发化学成分明确的无血清培养基。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于培养脐带间充质干细胞的培养基。解决现有培养基培养脐带间充质干细胞存在的增殖缓慢，细胞形态和生物学性状等易发生改变，无法满足干细胞的临床应用需求的问题。

本发明的一个目的在于提供一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，包括DMEM/F12、1～20ng/mL重组人成纤维细胞生长因子、1～20μg/mL重组人表皮生长因子、1～20μg/mL胰岛素、1～10mM L-谷氨酰胺、50～200μM 2-巯基乙醇、20～50nM亚硒酸钠、10～30μg/ml转铁蛋白、10～100mg/mL人血清白蛋白、50～200μg/mL纤粘连蛋白、50～200ug/ml黄芪多糖APS、10～50mg/L IL-3、10～50mg/L IL-6、45～55μg/L IL-r、10～50mg/L人参提取物、10～50mg/L玫瑰提取物、10～50mg/L茉莉花提取物、5～8mM维生素C。

优选地，培养基中含有5～15ng/mL重组人成纤维细胞生长因子、5～15μg/mL重组人表皮生长因子、5～18μg/mL胰岛素、5～8mM L-谷氨酰胺、80～150μM 2-巯基乙醇、25～40nM亚硒酸钠、15～25μg/ml转铁蛋白、30～80mg/mL人血清白蛋白、80～150μg/mL纤粘连蛋白、80～150ug/ml黄芪多糖APS。

优选地，培养基中含有10ng/mL重组人成纤维细胞生长因子、10μg/mL重组人表皮生长因子、10μg/mL胰岛素、5mM L-谷氨酰胺、100μM 2-巯基乙醇、30nM亚硒酸钠、25μg/ml转铁蛋白、50mg/mL人血清白蛋白、100μg/mL纤粘连蛋白、100ug/ml黄芪多糖APS、30mg/L IL-3、30mg/L IL-6、50μg/L IL-r、30mg/L人参提取物、30mg/L玫瑰提取物、30mg/L茉莉花提取物、5mM维生素C。

本发明另一目的是提供了一种脐带间充质细胞的传代培养及扩增的方法，具体步骤如下：

a.把保存在冻存管中的脐带间充质干细胞从液氮中取出，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动2min溶解，同时预热上述无血清的脐带间充质干细胞培养基；