[发明专利]一种普鲁兰酶突变体

说明书

本发明公开了一种普鲁兰酶突变体，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明的普鲁兰酶突变体的热稳定性和催化效率较野生型有了明显的改善，其中，F513Y在55℃下的酶活可达最适温度下酶活的81.96％，在40℃下的半衰期可达78h，K_cat/K_m可达962.91s^‑1·mg^‑1·mL，分别为野生型的2.2倍、2.6倍和1.8倍；507‑13在55℃下的酶活可达最适温度下酶活的84.60％，在40℃下的半衰期可达65h，K_cat/K_m可达639.37s^‑1·mg^‑1·mL，分别为野生型的2.3倍、2.2倍和1.2倍；507‑11的K_cat/K_m可达617.85s^‑1·mg^‑1·mL，是野生型的1.2倍。

技术领域

本发明涉及一种普鲁兰酶突变体，属于酶工程和微生物工程技术领域。

背景技术

淀粉是植物体中贮存的养分，主要贮存在植物种子和块茎中，储量十分丰富。除食用外，淀粉主要被用于糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的制备，应用十分广泛。在利用淀粉制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的过程中，高效水解淀粉中存在的α-1,4-葡萄糖苷键以及α-1,6-葡萄糖苷键十分重要。其中，α-1,6葡萄糖苷键的含量虽然较低，只有6％左右，但是，α-1,6-葡萄糖苷键会使得淀粉形成分支结构，并且，大部分的如α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶等的淀粉加工用酶都是α-1,4-葡萄糖苷键水解酶，不具有α-1,6-糖苷键水解活力或水解活力极低，这大大降低了淀粉的利用率、增加了淀粉的转化时间，导致利用淀粉水解制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的生产效率低下。

普鲁兰酶，又名普鲁兰多糖-6-葡聚糖水解酶(pullulan-6-glucanohydrolase)，它可以专一性切割支链糊精中的α-1,6葡萄糖苷键，若在利用淀粉水解制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的过程中将普鲁兰酶与α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶等淀粉加工用酶联用，无疑可以大大提高淀粉的利用率，缩短淀粉的转化时间，为提高利用淀粉水解制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的生产效率提供更多可能。

但是，现有的普鲁兰酶仍然存在很多缺陷，缺陷如下：

第一，现有的普鲁兰酶热稳定性差，例如，来源于Shewanella arctica的普鲁兰酶，其在40℃下的半衰期仅有20min；来源于Bacillus megaterium的普鲁兰酶，其在40℃下处理后，只能残余40％的酶活，而淀粉水解的过程常需要一定的温度(40℃左右)；

第二，现有的普鲁兰酶催化效率低，例如，来源于Bacillus megaterium的普鲁兰酶，其催化效率仅有0.14s^-1·mg^-1·mL；来源于Bacillus flexus的普鲁兰酶，其催化效率仅有117.9s^-1·mg^-1·mL，而实际生产要求较高的催化效率。

上述缺陷均使得现有的普鲁兰酶无法很好的用于淀粉水解制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的生产过程。因此，急需找到一种热稳定性好且催化效率高的普鲁兰酶。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是得到一种热稳定性好且催化效率高的普鲁兰酶。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种普鲁兰酶突变体，所述普鲁兰酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第513位氨基酸进行突变得到的；

或者，所述普鲁兰酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第507位至第513位氨基酸进行突变得到的；