[发明专利]一种L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法

说明书

本发明提供一种L‑草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，涉及生物技术领域，包括以下步骤：将富含大肠杆菌的二级种子液在火焰环境下接入到生物发酵罐中；采用间歇加入的方式向发酵罐中加入补料，控制空气进气流量在3vvm，发酵液的pH值为6.9，罐压为0.05MP，发酵的培养温度为35℃，发酵5‑7h后补加补料，当菌的OD长到50以上时，开始降温诱导并加入诱导剂IPTG，发酵的诱导温度为18℃，发酵3‑4天，得谷氨酸还原酶和葡萄糖还原酶，本发明不仅缩短了生产工艺的周期，还节约了能耗和原料的使用量，大大减少了生产的成本，对于后续催化合成L‑草铵膦减少菌株的使用，催化效率更高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法。

背景技术

酶(enzyme)是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA。酶的催化作用有赖于酶分子的一级结构及空间结构的完整。若酶分子变性或亚基解聚均可导致酶活性丧失。酶属生物大分子，分子质量至少在1万以上，大的可达百万。酶是一类极为重要的生物催化剂(biocatalyst)。由于酶的作用，生物体内的化学反应在极为温和的条件下也能高效和特异地进行。

目前，市场上的草铵膦大都是外消旋混合物，如果草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，能使草铵使用量降低50％，这对于提高原子经济性，降低使用成本，减轻环境压力具有重要意义。目前如制作L-草铵膦的不对称合成法多用于实验室，但不对称合成法工艺步骤多，收率低，所用的不对称合成试剂大多较昂贵，导致成本高，不利于大规模制备L-草铵膦。而生物酶法具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高及产物易分离纯化等优点。

本发明公开了大肠杆菌共产双还原酶的一种高效发酵工艺，该双酶联合转氨酶可催化酮酸生成L草铵膦，而且其发酵菌种具有很好的遗传稳定性，可以基本满足化工生产的需求。对应的酶活也均达到生产需要的标准。与现有的单酶发酵技术相比，本发明在等量碳源和氮源供给的情况下，可获得相同规模的酶量，既节省了生产的周期，又节省了生产的成本。同时，由于工业甘油的价格低廉，利用甘油作为发酵的碳源能进一步降低生产成本，也凸显了双还原酶发酵工艺的发展潜力。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，不仅缩短了化工生产工艺的周期，简化了生产工艺，还节约了能耗和原料的使用量，大大减少了生产的成本，对于后续催化合成L-草铵膦减少菌株的使用，催化效率更高，并且减少了多种菌株供酶催化反应，实现了一菌多酶催化反应，高效实用。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，包括以下步骤：

1)将富含大肠杆菌的二级种子液在火焰环境下接入到生物发酵罐中；

2)采用间歇加入的方式向发酵罐中加入补料，控制空气进气流量在3vvm，发酵液的pH值为6.9，罐压为0.05MP，发酵的培养温度为35℃，发酵5-7h后补加补料，当菌的OD长到50以上时，开始降温诱导并加入诱导剂IPTG，发酵的诱导温度为18℃，发酵3-4天，得谷氨酸还原酶和葡萄糖还原酶。

进一步的，步骤1)中，富含大肠杆菌的二级种子液是由一级种子液在摇床37℃下培养5个小时得到的，生物发酵罐为10L全自动不锈钢发酵罐，其径高比为1：3，总容积为10L，装液系数为70％，操作无死角。

进一步的，步骤2)中，发酵用空气经空气过滤器除菌处理后进入发酵罐体。