[发明专利]甲钴胺注射液有关物质的HPLC检测方法

说明书

本发明公开了一种甲钴胺注射液有关物质的HPLC检测方法。本发明HPLC检测方法以266nm的波长为检测波长，能够更充分的将杂质分离出来；该方法在流动相中加入了离子对试剂，增强了分析物在色谱柱上的保留时间，并采用优化的梯度洗脱程序进行洗脱，分析出的杂质个数多，经酸、碱、热、氧、光等破坏试验证明被分析物中各已知杂质和未知杂质能够彻底分离。本发明提供的HPLC检测方法专属性强，灵敏度和准确度高，方法耐用性好，同时采用外标法对氰钴胺和羟钴胺两个已知杂质进行限度控制，更能够确保注射液的安全、有效，质量可控。

技术领域

本发明涉及甲钴胺注射液的有关物质检测方法，属于甲钴胺注射液的杂质的分析或检测领域。

背景技术

甲钴胺属于辅酶型的一种维生素，甲钴胺甲基化的官能团能够参与到体内甲基转移作用中，从而对体内神经组织核酸、蛋白质和脂肪的新陈代谢等都具有良好促进作用。在人体代谢中，甲钴胺和腺苷钴胺能够直接参与体内代谢，对疾病起到直接治疗作用。研究发现甲钴胺极不稳定，尤其在水溶液条件下，见光迅速分解成羟钴胺，在生产和贮存过程中也会产生很多杂质，如已知杂质氰钴胺和羟钴胺，其结构式分别为图1和图2所示。

《中国药典》2015年版收录了甲钴胺原料和甲钴胺胶囊的质量标准，并没有甲钴胺注射液的检测标准。2015版药典中甲钴胺原料有关物质的检测方法采用的是等度高效液相色谱法，对甲钴胺对照品光破坏的溶液作为系统适用性溶液。该方法中甲钴胺的出峰时间在12分钟左右，甲钴胺中的两个已知杂质氰钴胺(合成起始物料)和羟钴胺(降解产物)不能有效分离，而且有关物质检测的灵敏度低，方法中要求调整流速使甲钴胺的出峰时间在12分钟，每次配制流动相的误差都会引起主峰保留时间的变化，每次试验前都需要测试流速，不仅操作麻烦，方法的耐用性不好，而且该方法中并未对已知杂质氰钴胺和羟钴胺做限度控制，不适合注射液的有关物质质量控制。

CN104122363 B公开了一种甲钴胺片有关物质的测定方法，该方法采用的是乙腈和磷酸盐缓冲溶液为流动相，采用的是梯度洗脱，主要是针对甲钴胺片的有关物质质量控制，该方法解决了包衣辅料干扰的问题，但其选择的检测波长范围在300～360nm，此波长范围尽管为已知杂质氰钴胺和羟钴胺的最大吸收波长，但对于其他未知杂质和破坏产生的杂质并不是最大吸收波长，因此，用该检测波长对有关物质检测检测杂质的个数少，灵敏度低，不适用注射剂这种高风险剂型的放行检验。

其它的文献报道中，仅有关于原料的有关物质检测方法，也未有甲钴胺注射液有关物质的检测方法报道。胡楚楚等(胡楚楚等.HPLC测定甲钴胺的含量及其有关物质.《华西药学杂志》2015.第3期.第30卷.第370-372页)公开了采用HPLC测定甲钴胺的含量及其有关物质的方法，该有关物质方法与《中国药典》2015版甲钴胺有关物质色谱条件基本一致，相应与2015版药典也存在同样的问题。

吴琼珠等(吴琼珠等.HLPC测定甲钻胺的有关物质.《南京军医学院学报》2003年.第4期.第25卷.第221-222页)公开了一种HLPC测定甲钻胺的有关物质的方法，该方法采用的是氨基柱，从该文献公开的色谱图看，甲钴胺与已知杂质羟钴胺分离度不高，尤其对样品进行破坏后产生的杂质多，很多未知杂质也很难达到基线分离，而且该色谱条件是反向色谱条件，而氨基柱常用于正相色谱条件的使用，这样的色谱条件导致色谱柱不耐用，易损坏。

总之，现有的甲钴胺注射液的有关物质的检测方法中不同程度的存在氰钴胺和羟钴胺已知杂质不能有效分离，不能有效的控制注射剂的产品质量、检测方法灵敏度低，耐用性差等缺陷，有待改进。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种能将氰钴胺和羟钴胺已知杂质有效分离、能有效控制注射剂的产品质量的甲钴胺注射液有关物质的HPLC检测方法；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种甲钴胺注射液有关物质的HPLC检测方法，将待检测的物质上色谱柱后，以流动相进行梯度洗脱；其中，所述的检测波长为220-380nm，优选为266nm。