[发明专利]一种活性化T淋巴细胞培养液及其活性化T淋巴细胞的制备方法

权利要求书

1.一种活性化T淋巴细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将血浆处理后收集白细胞，将1-10ml白细胞移入50ml细胞试管中；

2）准备T75细胞培养瓶,对白细胞进行2小时的PBMCs培养；

3）准备T225细胞培养瓶作为AT 培养瓶，向AT培养瓶里加入10-15ml的5ug/mlLymactin-T，扣上盖子，前后温柔的摇晃AT培养瓶直到液体覆盖整个底部，放在室温静置培养2小时；

4）步骤2）PBMCs的2小时培养结束后，用显微镜确保细胞黏附在培养瓶的底部，温柔的前后摇晃T75培养瓶使非黏附的细胞悬浮，转移细胞悬液到50ml试管中备用；使用下述步骤洗涤步骤3）中Lymactin-T包被的AT培养瓶；

洗涤步骤包括：

a．吸取，弃用培养瓶里的溶液；

b．向每个培养瓶里加入25ml 生理盐水并前后摇晃；

c．将生理盐水倒入一个无菌容器内，弃用；

d．重复b和c两次；

e．吸取清理培养瓶内和瓶嘴处剩余的溶液；

用移液器重新使50ml试管中的细胞悬浮，平均的把2-10ml细胞悬液转移到上述每个AT培养瓶中；

5）在一个50ml试管中配制好AT培养液，步骤4）加入细胞悬液的AT培养瓶中加入AT培养液直到40ml；扣上AT培养瓶的盖子，温柔的摇匀，把AT培养瓶放入培养箱培养7天，37℃，5%CO₂；

所述的AT培养液由以下物质组成：5-7ml 的ALyS505N-0；70-90ul的5x10^5 IU/ml IL-2；15-25ul的5x10^5 IU/ml IL-6；3-5ml自体血清；

6）AT细胞的收获：

a．准备新的50ml试管，制备培养液A：室温下向试管中加入43-46ml ALyS505N-0培养液、48-52ul 的2ug/ml 离子霉素和48-52ul的200ng/ml PMA；

b．准备新的250ml试管，用显微镜观察检测所有的AT培养瓶，再次确认内毒素检测结果为阴性，将所有培养液倒入250ml试管中；

c．转移步骤6）a中准备的25ml的培养液A到步骤6）b中的AT培养瓶中，放倒培养瓶；

d．离心步骤6）b的250ml试管，离心过后，弃用上层液体；

e．将步骤6）c中的剩余的全部培养液A转移到步骤6 ）d中的250ml试管中，重新使细胞悬浮，转移所有细胞悬浮液到步骤6）c中的AT培养瓶；

f．将步骤6）e的AT培养瓶放入培养机培养2.8-3.2小时，37℃，5% CO₂；培养结束后，使用移液器上下转移液体几次使细胞悬浮，转移细胞悬液到一个新的250ml试管中；加入8-12mlALyS505N-0到培养瓶中，用移液器使细胞悬浮；转移细胞悬液到250ml试管中；用肉眼和显微镜观察试管底部的黏附细胞；离心250ml试管后，弃用上层液体；用2-10ml的ALyS505N-0使细胞重新悬浮；如果使用了多个试管则转移所有的细胞悬液到其中一个试管内；加入ALyS505N-0直到50ml；用Trypan Blue stain计测细胞数量，计算存活率；离心250ml试管，吸取弃用上层液体，加入50ml ALyS505N-0使细胞悬浮；离心式管，取样用于FACS检测，准备细胞冷冻液暂存在冰上，执行无菌检测，将细胞暂存在冰上，向细胞试管中加入冷冻液，用移液器混匀，冷冻保存。

2.如权利要求1所述的一种活性化T淋巴细胞的制备方法，其特征在于步骤2）中：准备T75细胞培养瓶,加10ml室温下的ALyS505N-0培养液到每个培养瓶中,用10ml移液器向细胞试管中加入10ml ALyS505N-0,重新使细胞悬浮,加入1ml青链霉素双混合液，50ul的200mML-谷氨酰胺；向每个T75细胞培养瓶里转移5ml细胞悬浊液，扣上培养瓶盖子，慢慢的摇晃瓶子以使细胞悬液均匀，放进培养箱培养2小时，37℃，5% CO₂。

3.如权利要求1所述的一种活性化T淋巴细胞的制备方法，其特征在于步骤3）中：5ug/ml Lymactin-T采用以下制备方法：把50ul的1mg/ml Lymactin-T加入10ml hanks缓冲液制成。