[发明专利]一种基于纳米荧光探针检测细胞膜蛋白过表达的方法及其应用

权利要求书

1.筛选抑制细胞膜蛋白过度表达药物的方法，其特征在于：方法如下：

1）使用细胞刮刀将过表达小胶质细胞从培养瓶中分离，种在26个6孔板中使细胞数量为5×10⁵个，待4h细胞贴壁后，加入浓度为5 μg/ml的药物，置于5% CO₂培养箱中培养24h；取出细胞用冷PBS吹洗三遍后，用细胞刮刀将细胞从6孔板中分离，随后用1000 r/min，4℃的离心机离心4min，重新分散于1ml 10mmol/L Tris-HCl缓冲溶液中，利用细胞破碎仪在300w的条件下，超声3s，间隔7s，持续3min进行细胞破碎；根据差速离心法，置于低温离心机中进行细胞膜蛋白的分离；得到沉淀物置于冰上加入膜蛋白裂解液裂解，经过滤后测其浓度，置于-80℃中保存待用，得药物处理后的过表达的小胶质细胞膜蛋白溶液；

2）将步骤1）获得的药物处理后的过表达的小胶质细胞膜蛋白溶液，用PBS稀释，得蛋白质浓度为50 ug /mL的药物处理后的过表达的小胶质细胞膜蛋白溶液；

3）将纳米荧光探针过滤、透析、冻干，取0.004g冻干后的纳米荧光探针溶于200mL PBS缓冲溶液中，得浓度为0.02 mg/mL的纳米荧光探针溶液；所述纳米荧光探针溶液制备方法包括如下步骤：称取13 mmol组氨酸和2 mmol缬氨酸，溶于20 mL超纯水中，加入3 mmoL乙二胺，完全超声溶解后，在反应釜中210℃ 条件下加热15 h，得到纳米荧光探针溶液；

4）在96孔板中，每个孔中加入100μL步骤2）制备的蛋白质浓度为50 ug /mL的药物处理后的过表达的小胶质细胞膜蛋白溶液，每个孔中再加入100 μL浓度为0.02mg/mL的纳米荧光探针溶液，在20℃下孵化5min后，在荧光酶标仪上检测荧光强度值。