[发明专利]一种基于纳米荧光探针检测细胞膜蛋白过表达的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种基于纳米荧光探针检测细胞膜蛋白过表达的方法及其应用。于96孔板中，加入细胞膜蛋白溶液和纳米荧光探针溶液，于20‑25℃下孵化5‑10min后检测荧光强度。所述纳米荧光探针溶液的制备方法是：将碳源用水完全溶解，向溶液中加入小分子配体进行掺杂，超声溶解后在190‑220℃下加热反应，得纳米荧光探针，将纳米荧光探针经过滤，透析，冻干后分散于PBS缓冲溶液中，得到纳米荧光探针溶液。采用本发明的方法可以鉴别不同响应状态的细胞膜蛋白，而且还具有生物相容性好、安全无毒、作用效果稳定等特点。可特异性识别细胞膜蛋白的过表达，制备方法工艺简单、易于操作，制备成本低，易于推广。

技术领域

本发明属于荧光纳米材料技术领域，具体涉及一种基于纳米荧光探针检测细胞膜蛋白过表达的方法及其应用。

背景技术

蛋白质(protein)是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质是机体细胞的重要组成部分，是人体组织更新和修补的主要原料。它主要维持肌体正常的新陈代谢和各类物质在体内的输送。例如:载体蛋白对维持人体的正常生命活动是至关重要的。可以在体内运载各种物质。比如血红蛋白输送氧(红血球更新速率250万/秒)、脂蛋白输送脂肪、细胞膜上的受体还有转运蛋白等。另外，蛋白质广泛存于细胞膜，细胞质，以及细胞核等各个细胞器中。

细胞的各项生命活动与细胞膜蛋白密切相关，其可分为两类主要的转运蛋白，即：载体蛋白和通道蛋白。载体蛋白又称做载体、通透酶和转运器，能够与特定溶质结合，通过自身构象的变化，将与它结合的溶质转移到膜的另一侧。细胞膜蛋白具有许多重要的细胞功能，对生物体存在至关重要。他们具有超过60％的药物靶点，占细胞总蛋白的18％-30％。

细胞膜蛋白能接收外界信号的刺激使细胞做出反应，从而调节细胞的生命活动。细胞膜在生命活动中不单是细胞的物理屏障，是在细胞生命活动中有复杂功能的重要结构。细胞膜把细胞包裹起来，使细胞能够保持相对的稳定性，维持正常的生命活动。此外，细胞所必需的养分的吸收和代谢产物的排出都要通过细胞膜。所以，研究细胞膜蛋白的表达对人类了解生命活动有着至关重要的意义，特别的在疾病诊断，治疗等方面有着重要的指导意义。

小胶质细胞异常活化介导的神经炎症反应以释放细胞因子、趋化因子和自由基等损伤神经元和破坏神经功能为主要特征，并且该炎症反应与细胞膜蛋白密切相关。细胞膜相关的神经形炎症，在多种神经退行性疾病、脑缺血和脑外伤等中枢神经系统疾病的发病过程中具有重要的作用，因此抑制小胶质细胞过度活化，阻断促炎级联信号、抑制炎症反应被认为对上述疾病具有缓解甚至治疗作用。而抑制小胶质细胞膜蛋白的过度活化主要方法是抑制其细胞膜蛋白的过度表达。

目前研究膜蛋白结构的技术包括X射线衍射、核磁共振波谱、电子显微镜、原子力显微镜、红外光谱和圆二色谱等。其中X射线衍射和核磁共振波谱技术是对膜蛋白三维结构进行研究的主要方法。尤其利用固体核磁共振技术可在接近膜蛋白的天然环境的磷脂双分子层中研究膜蛋白的三维结构信息和动力学特征。但是上述检测方法存在一定使用的局限及问题，比如大型仪器依赖，成本高昂，时效性等等。

发明内容

针对现有的检测方法及目前应用的荧光探针所存在的不足，本发明的目的是提供一种基于纳米荧光探针检测细胞膜蛋白过表达的方法，本发明将荧光探针迅速高效的与细胞膜蛋白进行结合，根据细胞膜蛋白的结合位点的数量以及蛋白亚基的数量不同产生了不同的荧光信号，在酶标仪和荧光分光光度计上得以很好的区分。

本发明采用的技术方案为：一种基于纳米荧光探针检测细胞膜蛋白过表达的方法，包括如下步骤：于96孔板中，加入细胞膜蛋白溶液和纳米荧光探针溶液，于20-25℃下孵化5-10min后检测荧光强度。所述纳米荧光探针溶液的制备方法是：将碳源，用水完全溶解，向溶液中加入小分子配体进行掺杂，超声溶解后在190-220℃下加热反应，得纳米荧光探针，将纳米荧光探针经过滤，透析，冻干后分散于PBS缓冲溶液中，得到纳米荧光探针溶液。