[发明专利]一种基于三维微载体细胞培养的原位传代方法

说明书

本发明公开了一种基于三维微载体细胞培养的原位传代方法。本发明提供了基于三维微载体细胞培养的原位传代方法，包括如下步骤：将种子微载体接入新的微载体；所述种子微载体为培养有待传代细胞的微载体。本发明方法避免了传统二维细胞的消化传代，既可减少消化液对细胞的损伤，又可省去消化传代等繁琐的操作过程，因此在大规模培养扩增时会节省相当的人力物力，并且可获取高质量细胞。节省时间，细胞消化下来再接种到需要时间操作，而此传代方式会省去操作时间。选择原位传代，不需要用到消化液等试剂耗材，精简过程、降低成本。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种基于三维微载体细胞培养的原位传代方法。

背景技术

在细胞培养扩增过程中，细胞传代是一个关键步骤。随着培养时间的延长和细胞不断分裂，培养器皿表面逐渐长满细胞，细胞之间相互接触会发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止，因此需要将细胞收集再分成若干份，重新接种到若干个培养器皿内，以提供更多的培养表面，再进行培养。这一程序常称为传代或传代培养。对于贴壁细胞，无论采取二维培养或三维培养，传统意义的细胞传代需要将细胞从培养器皿的基底上(比如培养瓶、培养皿)收获下来(称为消化)之后再接种到新的培养器皿里进行传代。

常用的消化方法主要有酶消化法、离子螯合剂、物理法和冷冻法。其中最常用的是酶消化法。酶消化的方法受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量、细胞类型、密度等诸多因素的影响。消化过程中还需实时观察细胞的状态避免造成过度消化，否则对细胞损害很大。同样的，离子螯合剂、物理法(即直接吹打或用细胞刮子将干细胞刮下来)、冷冻法都对细胞有不同程度的损伤。

现有的三维细胞传代，大多使用胰酶等消化细胞的试剂进行细胞的消化传代，将细胞从三维材料中消化成游离的单悬细胞后，然后再重新种植到新的材料中，进行扩增培养。其中，关键问题在于，三维培养的细胞难于用胰酶进行，一方面消化不完全大量细胞呈现三维团簇生长，胰酶很难深入快速深入内部实现完全消化，另一方面为了消化完全，胰酶的消化时间过长，导致细胞大量损伤或死亡，影响了细胞制品的质量。而且，现有的三维细胞传代会打断细胞培养扩增过程中三维培养环境的连续性。且随着传代次数的增加，细胞所受的损伤逐渐累积，对细胞质量产生影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于三维微载体细胞培养的原位传代方法。

本发明所提供的方法以三维微载体为培养基底，可实现通过直接添加新的微载体就能完成细胞原位传代，避免需要将细胞收获下来再接种到新的培养基底上的复杂操作。该方法可实现细胞传代不再打断三维培养的过程，从而在制备三维培养的细胞制品或组织工程产品时，全程保持细胞处于三维状态。可以实现全封闭式的细胞培养和连续扩增。

本发明要求保护一种基于三维微载体细胞培养的原位传代方法。

本发明所要求保护的基于三维微载体细胞培养的原位传代方法，可包括如下步骤：将种子微载体接入新的微载体；所述种子微载体为培养有待传代细胞的微载体。所述新的微载体是指不含有细胞的微载体。

进一步地，所述方法中，所述种子微载体中的细胞密度为1万-100万细胞/mg微载体(如10-50万细胞/mg微载体，再如12-50万细胞/mg微载体)。所述种子微载体与所述新的微载体的比例为0.0002-200mg种子微载体/mg新的微载体(如2-15mg种子微载体/100mg新的微载体)。

更进一步地，所述种子微载体中的细胞密度为12万-50万细胞/mg微载体(尤其适用于下文所述静态原位传代)或者15万-50万细胞/mg微载体(尤其适用于下文所述动态原位传代)。所述种子微载体与所述新的微载体的比例为1-3mg种子微载体/20mg新的微载体(尤其适用于下文所述静态原位传代)或2-6.7mg种子微载体/100mg新的微载体(尤其适用于下文所述动态原位传代)。

所述方法可为基于三维细胞微载体培养的静态原位传代方法或者动态原位传代方法。