[发明专利]一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒及方法

权利要求书

1.一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒，包括试剂盒盒体以及与所述试剂盒盒体配合的试剂盒盒盖，其特征在于，所述的试剂盒盒体内壁紧贴有保温隔水层，所述的试剂盒盒体内底部设有冷盒，所述的冷盒上设置有底盒，所述的底盒内设置有多个放置槽和多个放置孔，所述的多个放置槽内设置有螺旋样品室和微流控芯片，所述的多个放置孔内设置有多个试剂瓶，多个试剂瓶形成试剂瓶组。

2.根据权利要求1所述的上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述的保温隔水层包括珍珠棉、覆合在所述珍珠棉上的铝箔以及贴合在所述铝箔上的PVC层。

3.根据权利要求1所述的上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒盒体通过所述底座隔断分为上下两层，上层为包括底座的试剂瓶组、螺旋样品室和微流控芯片的放置层，下层为冷盒的放置层。

4.根据权利要求1所述的上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述的底座的放置孔为有底的圆孔，所述的放置槽为通槽。

5.根据权利要求1所述的上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述的底座上放置有试剂板。

6.根据权利要求5所述的上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂板为96孔板。

7.根据权利要求1所述的上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂瓶组中的各试剂瓶分别装有生物素标记的EpCAM抗体、生物素标记的的抗CSV抗体、荧光素标记的抗PanCK抗体、荧光素标记的抗Vimentin抗体、荧光素标记的抗CD45抗体、PD-L1一抗、荧光素标记的PD-L1二抗。

8.一种上皮间质混合型及PD-L1阳性循环肿瘤细胞的富集检测方法，其特征在于，采用权利要求7所述的上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒，该方法具体包括以下步骤：

1)生物素标记的上皮间质混合抗体的微流控免疫捕获载体的制备；

所述的生物素标记的上皮间质混合抗体采用生物素标记的EpCAM抗体和生物素标记的的抗CSV抗体；

2)上皮间质混合型CTCs的分离富集；

3)采用荧光素标记的上皮间质混合型抗体对不同亚型CTCs的免疫检测；

所述的荧光素标记的上皮间质混合型抗体采用荧光素标记的抗PanCK抗体、荧光素标记的抗Vimentin抗体、荧光素标记的抗CD45抗体；

4)采用PD-L1一抗与荧光素标记的PD-L1二抗对步骤3)中捕获的不同亚型CTCs的PD-L1表型检测。

9.根据权利要求8所述的富集检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述的生物素标记的上皮间质混合抗体中生物素标记的EpCAM抗体的质量百分数为35％～60％；所述的生物素标记的上皮间质混合抗体中生物素标记的的抗CSV抗体的质量百分数为25％～50％；

步骤3)中，所述的荧光素标记的抗PanCK抗体、荧光素标记的抗Vimentin抗体、荧光素标记的抗CD45抗体混合的体积比为1：1：1。

10.一种上皮间质混合型及PD-L1阳性循环肿瘤细胞的富集检测方法，其特征在于，采用权利要求1～6任一项所述的上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒，所述的试剂瓶组中各试剂瓶装有所需要的具体试剂，该方法具体包括以下步骤：

1)生物素标记的上皮间质混合抗体的微流控免疫捕获载体的制备具体包括：

用移液器吸取链霉亲和素溶液，加入微流控载体，在10～35℃下孵育3～5h后放置在环境湿度低于30％的干燥室干燥20～28h，直至微流控载体内无液体残留，用乙醇处理微流控载体，然后立即用PBS缓冲液冲洗微流控载体；

将生物素标记的抗EpCAM抗体和生物素标记的抗CSV抗体的混合液，加入微流控载体内35～39℃孵育25～35min后，用PBS缓冲液冲洗微流控载体，加入捕获增强液至微流控载体内，10～35℃孵育0.5～1.5h，用PBS缓冲液冲洗微流控载体，完成生物素标记的上皮间质混合抗体的微流控免疫捕获载体的制备，将其置于湿盒备用；

2)上皮间质混合型CTCs的分离富集具体包括：

用PBS缓冲液稀释外周血，之后加入到含有单核细胞分离液的梯度离心管的多孔屏障上方，离心后，吸取单核细胞层，并将其转移至无菌离心管中，使用细胞清洗液洗涤单核细胞，离心，弃除上清液，再加入细胞清洗液轻柔重悬单核细胞，完成CTCs的粗分离液的制备；

采用微流泵系统吸取CTCs的粗分离液，以3～4mL/h的注入速度缓慢匀速注入步骤1)中制备好的生物素标记的上皮间质混合抗体的微流控免疫捕获载体中，然后吸取PBS缓冲液冲洗微流控免疫捕获载体，完成上皮间质混合型CTCs的富集，得到富集有上皮间质混合型CTCs的微流控载体；

3)采用荧光素标记的上皮间质混合型抗体对不同亚型CTCs的免疫检测，具体包括：

取细胞固定液，注入步骤2)中富集有上皮间质混合型CTCs的微流控载体中，10～35℃反应15～25min后，吸取PBS缓冲液冲洗微流控载体，完成细胞固定；

用移液器吸取细胞通透液，注入已完成细胞固定的微流控载体内，置于避光湿盒中10～35℃作用8～12min后，吸取PBS缓冲液冲洗微流控载体，完成细胞通透；

将荧光素标记的抗PanCK抗体、荧光素标记的抗Vimentin抗体、荧光素标记的抗CD45抗体、染色阻断液A、染色阻断液B与抗体稀释液的混合液加入到已完成细胞通透的微流控载体内10～35℃避光孵育1.5～2.5h后，用PBS缓冲液缓慢微流控载体，接着吸取核酸染色液注入微流控载体，置于避光湿盒中10～35℃孵育10～20min，用PBS缓冲液冲洗微流控载体，完成上皮型CTCs、上皮间质混合型CTCs、与间质型CTCs的免疫检测，用倒置荧光显微镜观察荧光显色情况；

4)采用PD-L1一抗与荧光素标记的PD-L1二抗对步骤3)中捕获的不同亚型CTCs的PD-L1表型检测，具体包括：

将PD-L1一抗、染色阻断液A、染色阻断液B与抗体稀释液混合液加入步骤3)中已反应完成的微流控载体中，置于湿盒中避光10～35℃孵育1.5～2.5h后，用PBS缓冲液冲洗微流控载体；

将荧光素标记的PD-L1二抗用抗体稀释液加入已完成PD-L1一抗反应的微流控载体中，置于湿盒中避光10～35℃孵育1.5～2.5h后，用PBS缓冲液冲洗微流控载体，完成不同亚型CTCs的PD-L1表型检测，用倒置荧光显微镜观察染色结果。