[发明专利]猪C1QTNF3基因过表达载体质粒的构建方法及其表达水平的检测在审
| 申请号： | 201910512086.9 | 申请日： | 2019-06-13 |
| 公开（公告）号： | CN110257391A | 公开（公告）日： | 2019-09-20 |
| 发明（设计）人： | 张雪莲;蔡春波;曹果清;秦本源;吴怡琦;李文霞;王鹤洁;郭玉龙;刘亚丹;高鹏飞;郭晓红;李步高 | 申请（专利权）人： | 山西农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/12 | 分类号： | C12N15/12;C12N15/85;C12N15/11;C12Q1/6888;C12Q1/686 |
| 代理公司： | 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君;商秀玲 |
| 地址： | 030801 山西省晋中市太*** | 国省代码： | 山西;14 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基因过表达 载体质粒 构建 基因表达水平 检测 表达水平 引物 分子生物学技术 功能研究 应用提供 基因 | ||
1.用于构建猪C1QTNF3基因过表达载体质粒的引物，其特征在于，包括引物TY-C1QTNF3-F和TY-C1QTNF3-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。
2.一种构建猪C1QTNF3基因过表达载体质粒的方法，其特征在于，利用引物TY-C1QTNF3-F和TY-C1QTNF3-R PCR扩增C1QTNF3基因，利用同源重组方法将C1QTNF3基因与pIRES2-EGFP-3×flag连接；
所述引物TY-C1QTNF3-F和TY-C1QTNF3-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取猪组织的总RNA，反转录成cDNA；
(2)以步骤(1)的cDNA为模板，利用引物TY-C1QTNF3-F和TY-C1QTNF3-R PCR扩增C1QTNF3基因；
(3)利用限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切pIRES2-EGFP-3×flag；
(4)将所述C1QTNF3基因与经双酶切的pIRES2-EGFP-3×flag进行同源重组连接，构建猪C1QTNF3基因过表达载体质粒；
优选地，所述PCR扩增的反应程序如下：95℃预变性5min，95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。
4.猪C1QTNF3基因表达水平的检测引物，其特征在于，包括引物C1F和C1R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3-4所示。
5.含有权利要求4所述检测引物的试剂盒；
优选地，所述试剂盒还包括用于扩增18S rRNA内参基因的引物18S-F和18S-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5-6所示。
6.权利要求4所述检测引物或权利要求5所述试剂盒在检测猪C1QTNF3基因表达水平中的应用。
7.一种猪C1QTNF3基因表达水平的检测方法，其特征在于，利用权利要求4所述检测引物或权利要求5所述试剂盒进行荧光定量PCR检测。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测猪细胞的总RNA，反转录成cDNA；
(2)以步骤(1)的cDNA为模板，利用引物18S-F和18S-R、荧光定量PCR扩增18S rRNA内参基因，同时利用引物C1F和C1R、荧光定量PCR扩增C1QTNF3基因；
(3)分析步骤(2)的荧光定量PCR结果，获得的猪C1QTNF3基因表达水平。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，45个循环；95℃15s，65℃1min，95℃15s制作熔解曲线。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的20μL反应体系为：2×GoTaq qPCR Master Mix 10μL，去RNA酶水7.4μL，10μM上游引物0.3μL，10μM下游引物0.3μL，cDNA模板2.0μL。
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