[发明专利]猪C1QTNF3基因过表达载体质粒的构建方法及其表达水平的检测

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及猪C1QTNF3基因过表达载体质粒的构建方法及其表达水平的检测。本发明提供了序列如SEQ ID NO:1‑2所示的用于构建猪C1QTNF3基因过表达载体质粒的引物，以及猪C1QTNF3基因过表达载体质粒的构建方法；本发明还提供了序列如SEQ ID NO:3‑4所示的用于检测猪C1QTNF3基因表达水平的引物，以及检测猪C1QTNF3基因表达水平的方法。本发明为猪C1QTNF3基因的功能研究及其应用提供了有效方法和基础。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及猪C1QTNF3基因过表达载体质粒的构建方法及其表达水平的检测方法。

背景技术

C1QTNF3(CORS26)又称CTRP3或Cartducin，是2003年发现的脂肪因子。C1QTNF3的生理功能包括：调节软骨细胞增殖及骨关节疾病；调节内分泌、糖脂代谢、线粒体生物合成、免疫、炎症反应、细胞凋亡、血管新生、血管钙化以及心室重塑等多种生理、病理过程；调节机体睾酮、脂肪因子的分泌。C1QTNF3属于分泌蛋白家族，可分为4个结构域：N-末端信号肽、可变域、胶原重复序列及C-末端gC1q 球型域。人和小鼠C1QTNF3的N-末端含疏水性的信号肽，无跨膜结构域，可能是非膜蛋白。C1QTNF3在人体细胞中主要以二聚体和多聚体形式存在，但与脂联素和其他家族成员之间不能形成异源二聚体或多聚体。

研究表明，CTRP家族的CTRP1、CTRP6和CTRP9可通过活化 AdipoR1发挥生物学效应。但关于CTRP3还未有相关研究。溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1)和溶酶体膜蛋白2(LAMPII)作为C1QTNF3 的潜在受体，可直接与C1QTNF3结合。C1QTNF3转录调控通过转录激活因子结合位点参与调节，其中，垂体特异转录因子1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和特异性蛋白1(SP1)可降低 C1QTNF3的表达，而c-Jun是唯一已知的增加C1QTNF3表达的转录因子。

在小鼠内皮细胞系MSS31中，C1QTNF3剂量依赖性的增加内皮细胞的增殖和迁移。推测C1QTNF3通过ERK1/2和p38MAPK促进内皮细胞的增殖，而通过ERK1/2介导细胞迁移。然而，目前对C1QTNF3 基因的研究大量集中在人和小鼠上，目前尚未有关于猪C1QTNF3基因的研究报道。猪C1QTNF3基因表达载体的高效构建和猪C1QTNF3 基因表达水平的快速、特异、准确检测对于猪C1QTNF3基因的功能研究具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供用于构建猪C1QTNF3基因过表达载体质粒的引物、猪C1QTNF3基因过表达载体质粒的高效构建方法以及用于检测猪C1QTNF3基因表达水平的特异性引物和猪C1QTNF3基因表达水平的快速、特异、准确的检测方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：为实现猪C1QTNF3 基因的高效特异扩增以及与表达载体质粒的快速高效连接，本发明通过大量筛选和人工优化获得了用于猪C1QTNF3基因扩增和过表达载体质粒构建的引物，其序列如SEQ ID NO.1-2所示，该引物能够实现猪C1QTNF3基因的特异扩增，并且能够与表达载体质粒进行高效的同源重组连接，快速、准确地构建猪C1QTNF3基因过表达载体质粒，将上述构建的猪C1QTNF3基因过表达载体质粒导入猪细胞中，可获得过表达猪C1QTNF3基因的细胞。为便于猪C1QTNF3基因的表达水平检测，本发明通过大量筛选和人工优化获得了用于荧光定量PCR进行猪C1QTNF3基因表达水平检测的特异性引物(序列如SEQ ID NO.3-4所示)，与其它引物相比，序列如SEQ IDNO.3-4所示的引物能够实现特异、准确的猪C1QTNF3基因的表达水平检测。

具体地，本发明提供用于构建猪C1QTNF3基因过表达载体质粒的引物，包括引物TY-C1QTNF3-F和TY-C1QTNF3-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。

上游引物，TY-C1QTNF3-F：